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地胆草(Elephantopus scaber Linn.)是广东地区常用中药材之一。其有效成分主要为倍半萜内酯类成分、咖啡酰奎宁酸类成分,具有抗病毒、抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗糖尿病、保肝等多种重要活性。然而对于其有效成分的提取工艺研究较少,对其多糖的研究也未见报道。本实验利用柱层析提取方法,对其有效成分的提取进行了研究,同时研究优化了其多糖的提取工艺,并对其多糖的抗氧化活性,免疫调节活性进行了研究。 柱层析法提取地胆草有效成分。以去氧地胆草内酯、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、多糖含量为指标,考察了提取溶剂,溶剂用量,浸泡时间等因素对于有效成分提取率的影响。确定地胆草柱层析提取的最佳工艺为:地胆草全草粉碎过20目、80目筛,留取中间部分粉末作为提取材料,室温下,用石油醚∶乙醇(6∶4)混合溶剂按料液比1∶4.5装入层析柱,浸泡5小时后,以1BV/h的速度洗脱,收集12.5倍提取液后,改用5倍量60%乙醇浸泡1小时,再以1BV/h的速度洗脱,收集15倍提取液后,改用6倍量水浸泡2小时,以1BV/h的速度洗脱,收集18倍提取液。将三种提取液处理后,以高效液相或分光光度法测定其含量,最终与对照方法相比,去氧地胆草内酯、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸含量高于传统方法,而多糖含量低于传统方法。 地胆草多糖的提取工艺研究。以地胆草多糖提取率为指标,考察了提取温度、提取时间、料液比、提取次数分别对热水浸提法,超声辅助提取法提取地胆草多糖的影响,利用正交设计实验法优化了两者的最佳提取工艺,并对不同前处理工艺,对地胆草多糖热水浸提法的影响进行了比较。最终确定地胆草多糖的最佳提取工艺为:地胆草粉末,用石油醚∶乙醇(6∶4)混合溶剂按料液比1∶4.5装入层析柱,浸泡5小时后,以1BV/h的速度洗脱,收集12.5倍提取液后,改用5倍量60%乙醇浸泡1小时,再以1BV/h的速度洗脱,收集15倍提取液后,将地胆草粉末取出干燥,用热水浸提法,按照料液比1∶15,提取温度70℃,提取时间1h,提取两次浸提地胆草多糖。其多糖提取率高于传统前处理方法。 地胆草多糖的抗氧化活性。脱蛋白除色后的地胆草多糖,采用DPPH自由基清除法、羟基自由基清除法、总还原力测定,衡量其体外抗氧化能力。结果显示:0.1mg/mL的地胆草多糖对于DPPH自由基的清除率高于同浓度的BHT,可达到80%。在实验条件下0.2mg/mL以下浓度时,地胆草多糖对羟基自由基几乎没有清除效果,之后随着浓度升高其清除效果增强,1mg/mL的地胆草多糖其羟基自由基清除率可达55%左右。地胆草多糖总还原能力在1.0mg/mL时,约等同于0.1mg/mL的抗坏血酸,之后总还原能力随浓度升高而升高。 地胆草多糖的免疫调节活性。脱蛋白除色后的地胆草多糖,利用MTT法测定其小鼠RAW264.7细胞细胞活力影响。结果显示:在地胆草多糖0.125mg/mL至1.25mg/mL的剂量范围内对小鼠RAW264.7细胞具有促进增殖的作用;利用ESILA试剂盒测定了地胆草多糖对于小鼠RAW264.7细胞TNF-α释放的影响,结果显示低浓度(0.125mg/mL)的地胆草多糖,未显示促进TNF-α释放的功能,中浓度(0.625mg/mL)、高浓度(1.25mg/mL)的地胆草多糖,显示了促进TNF-α释放的功能;利用ESILA试剂盒测定了地胆草多糖对于小鼠RAW264.7细胞IL-1β释放的影响,结果显示低浓度(0.125mg/mL)的地胆草多糖,显示促进IL-1β释放的功能,中浓度(0.625mg/mL)、高浓度(1.25mg/mL)的地胆草多糖,未显示促进IL-1β释放的功能。