氨基甲酸乙酯（EC）现已被证实是一种致癌物质,具有多位点致癌性和基因毒性。经各国学者研究发现其广泛存在于发酵食品及酒精饮料中,对人类健康有一定危害。在发酵酒中,EC的主要由尿素和乙醇反应生成。一些能在发酵酒苛刻环境下高效分解尿素的酸性脲酶,逐渐受到人们的关注。本课题基于一种来源于普罗维登斯菌JN-B815（Providencia rettgeri JN-B815）的酸性脲酶,进行初步分离纯化,并以京尼平为交联剂进行交联。发现当京尼平浓度为0.3%、交联时间为2.5 h时,与京尼平发生交联作用而结合的蛋白含量达到最大,为118 mg。所得交联脲酶聚集体在4℃储存10 d后,脲酶酶活仍保留60%以上。以实验室前人调取的酸性脲酶全基因序列为基础,利用软件VectorNTI进行分析,扩增脲酶结构基因ureABC并在E.coli BL21（DE3）中进行表达,表达出的脲酶脱辅基蛋白具有生物活性。通过单因素实验对培养进行优化,优化后发现最佳Ni2+浓度为1.5mmol·L^-1、最适诱导温度25℃、IPTG添加量为0.5 mmol·L^-1时酶活最高,最宜诱导时间为10 h。优化培养条件后,脲酶酶活为0.69 U·mL^-1,EC降解酶酶活为0.29 U·m L^-1。酶液用镍柱进行纯化,纯化后酶液达到电泳纯。脲酶和EC降解酶比酶活分别为2.10U·mg^-1和0.60 U·mg^-1,纯化倍数分别为1.75倍和1.22倍。从分子角度证实了此酶为双功能酶,同时兼具有脲酶和氨基甲酸乙酯降解酶活性。对纯化后的脲酶脱辅基蛋白的pH稳定性和乙醇耐受性进行考察,发现其在pH 4-7的范围内酶活保留率达80%以上。且具有良好的乙醇耐受性,在5%-25%的乙醇浓度中,脲酶和EC降解酶酶活均能保留50%以上。应用于模拟酒体系中,30 h后,尿素去除率超过50%。用同源建模的方法对酸性脲酶的UreC进行结构模拟,模拟得出的结构分别与底物尿素和EC进行分子对接。分析对接结果发现尿素作为配体时与脲酶活性中心氨基酸残基形成三个氢键,而EC作为配体时仅与活性中心的氨基酸残基形成一个氢键,且EC与活性中心结合时的空间位阻比尿素大。由于可溶性表达的脲酶酶活较低,构建重组质粒使脲酶的结构基因ureABC与辅助基因ureEFGD共表达。表达的脲酶包涵体进行复性并用镍柱纯化。纯化后脲酶比酶活为11.80 U·mg^-1,而EC降解酶比酶活为3.80 U·mg^-1。两种酶活较无辅助基因共表达时分别提高了5.62倍和6.33倍。通过响应面对重组脲酶表达条件进行优化,研究培养条件对脲酶包涵体结构的影响,发现最易复性脲酶包涵体最适培养条件为诱导温度21.3℃,IPTG浓度为0.75 mmol·L^-1,诱导时间为12.5 h。对复性后脲酶用圆二色性光谱分析发现,与脲酶二级结构预测结果有一定的差别.复性后的脲酶二级结构中α螺旋、β折叠和其他二级结构所占比例分别为37.2%,20.1%和42.7%。