论文部分内容阅读
目的本文目的是研究肝脏肿瘤细胞调控氧化应激的机制及肿瘤干细胞在抗氧化应激过程中的作用,探寻参与调节肿瘤干性特征与抗氧化应激过程的相交叉的分子靶点,并人为干预后,进一步对比肝脏肿瘤细胞抗氧化应激能力及干性特征的变化。从而从肿瘤干细胞具有较强抗氧化应激能力的生物学特性角度为肿瘤的临床治疗、基础研究及新药研发提供新的策略与思路。方法1.对比肝细胞癌（HCC）细胞系Huh7与SMMC-7721对外源性ROS（H2O2）抵抗能力及两组细胞系中参与ROS调控的相关分子表达差异,探究肝癌细胞对ROS抵抗的初步机制;2.进一步分离Huh7细胞中抗ROS的亚群,并与普通Huh7细胞比较抗ROS能力及调控ROS代谢的相关分子表达的差异,筛选出调节通路中的关键分子（β-catenin）;3.使用β-catenin阻滞剂XAV939阻断Wnt/β-catenin信号通路,观察Huh7细胞抗ROS能力的变化;4.通过慢病毒干扰Huh7细胞系内ROS产生基因Nox1,人为减少细胞内ROS的产生,来比较Nox1基因干扰组与GFP（绿色荧光）对照组细胞抗ROS能力、干性特征及相关分子表达的变化,进而探究ROS调控能力与肿瘤干性特征之间的关系。结果1.经H2O2作用后,相对于SMMC-7721细胞,Huh7细胞凋亡坏死数目更少,活性更强,细胞内ROS水平更低,同时相对高表达干性分子CD133、bmi-1,DNA修复基因Rad51、ROS清除酶基因SOD2。2.肝癌细胞Huh7内存在具有较强抗ROS能力的亚群（Huh7-ROS）,该亚群细胞相对于普通的Huh7细胞高表达bmi-1、CD133、Bcl-2、SOD1,并且在经H2O2作用后,凋亡坏死数目更少,活性更强,细胞内ROS水平更低。3.相对于未用XAV939处理的Huh7细胞,经XAV939处理的Huh7-XAV939组细胞在H2O2作用后,细胞凋亡坏死数目更多,活性更低,细胞内ROS水平更高,而在不使用H2O2情况下即H2O2浓度为0umol/ml时,Huh7细胞的凋亡和坏死及细胞活性都没有差异。4.干扰Huh7细胞内ROS产生基因Nox1的实验组细胞（Huh7-siNox1）,相对于普通的对照组绿色荧光细胞（Huh7-GFP）,不但在H2O2作用后细胞活性更高,而且还有更强体内致瘤能力、集落形成能力。结论1.肝癌细胞拥有较强的抗ROS的能力有赖于肿瘤干性分子、DNA修复基因及清除酶基因的共同作用。2.肝癌细胞内存在抗ROS的亚群细胞,这一亚群也同时高表达肿瘤干性分子、ROS清除酶基因、DNA修复基因以及肿瘤干细胞信号通路分子β-catenin基因。3.β-catenin基因调控肿瘤细胞的自我更新等干性细胞学特性,在肿瘤细胞抗ROS过程中同样发挥作用。XAV939作为β-catenin基因的特异性阻滞剂,可以在不会诱导细胞凋亡和坏死的浓度水平抑制肝脏肿瘤细胞调控ROS抵抗的能力,进而可增加化疗药杀伤肿瘤细胞的效应,其有可能成为化疗“增敏剂”,进而在化疗过程中起到辅助作用。4.通过干扰Nox1基因降低内源性ROS的产生可以增强Huh7细胞抗ROS的能力并激活肿瘤细胞的干性特征,Nox1分子表达的高低及肿瘤细胞中ROS的水平可能作为为患者预后评判的标准和相关治疗的分子靶点来研究。