研究背景急性脊髓损伤(Spinal Cord Injury, SCI)是一类严重的高致瘫性的中枢神经创伤,发病人数逐年增长。脊髓损伤后修复一直是神经创伤领域的研究热点。研究表明,局部微循环障碍是急性SCI后脊髓继发性损伤加剧的重要原因,改善微循环对于促进脊髓创伤后修复意义匪浅。川芎嗪(Tetramethylpyrazine, TMP)是一种从中药川芎中提取的生物活性单体,具有积极的抗缺血作用。近年来,国内外动物模型研究表明TMP对急性SCI具有保护作用。本课题组亦在前期研究中观察到TMP能增加损伤邻近段脊髓的新生血管数目,这可能是TMP早期改善创伤后缺血的新途径,但具体机制尚需深入研究。为此,本研究以大鼠急性SCI模型为基础,利用Micro-CT和血管免疫荧光技术分别观察TMP对受损脊髓微血管网络3D和2D结构的影响,并结合分子生物学技术检测HIF-1α和VEGF蛋白的活化水平,以求明确TMP治疗与SCI后血管再生的关系,为TMP用于急性SCI后抗缺血治疗的临床前评估提供科学依据。第一章利用现代显微放射影像学技术实现大鼠脊髓微血管网络的三维可视化目的探讨Micro-CT和IL-XPCT显微放射影像学技术在大鼠正常脊髓微血管网络3D成像研究中的应用价值,为血管网络结构的形态计量学分析提供新的思路。方法(1)利用Microfil血管造影剂对正常SD大鼠(n=4)进行有效血管灌注塑型,Micro-CT扫描并重建脊髓3D血管网络,Micro-view软件进行血管形态计量学分析；(2)取Microfil造影后的SD大鼠(n=4)T10段脊髓标本浸润于冬青油中24-48h后真空保存,样品经IL-XPCT扫描后,利用VG Studio Max软件对脊髓微血管网络进行3D重建。结果(1)微血管网络3D图形清晰呈现出正常10m胸髓的血供网络,髓内、外血供走形、排列和分布等与经典的脊髓血供示意图高度一致；(2)髓内血供分为中央沟动脉系统和穿支动脉系统,前者来源唯一,后者来源广泛,两者微血管结构分明,排列有序,共同营养灰质神经细胞；(3)微血管网络高密度集中覆盖于脊髓灰质区,白质区血管分布稀疏,形成明显的灰、白质微血管密度落差；(4) Micro-CT和IL-XPCT对微血管管径的有效分辨率均已达微米量级,特别是IL-XPCT最细可分辨的微血管直径至7.4μm左右。结论(1)脊髓灰质区神经组织相对于白质区对血供的需求存在较大依赖；(2) Micro-CT可作为一种新的有潜力的体视学方法用于大鼠脊髓微血管网络的形态学观察和容量性评估；(3) IL-XPCT可作为一种新的有潜力的超高分辨率可视化技术用于大鼠脊髓微血管3D结构性观察。第二章川芎嗪对大鼠损伤脊髓微血管3D/2D形态学的影响目的探讨TMP对大鼠急性SCI后微血管结构性和容量性参数的影响,进一步明确TMP对受损脊髓微循环的保护作用。方法SD大鼠共85只,其中5只大鼠只行椎板减压术,不予脊髓打击作为正常对照组(Sham组)。其他80只大鼠行改良Allen’s打击法制作急性脊髓损伤模型,然后随机分为TMP组(n=40)和NS组(n=40)。TMP组大鼠在术后30min开始给予腹腔注射TMP (200mg/kg),连续治疗5天(1、3天组分别给药至处死前),其中20只大鼠于术后1、3、7和14天进行Microfil血管造影术,并取T10段造影脊髓标本进行Micro-CT检测和厚组织切片。Micro-CT检测的3D定量分析参数包括血管容积分数(VVF)、血管平均厚度(M.Th)和间距(M.Sp)以及血管连接密度(Conn.D);剩余20只大鼠不行血管造影,标本进行HE染色和血管免疫荧光染色,一抗为小鼠抗大鼠RECA-1,用于标记血管内皮细胞,2D评估指标包括微血管数目和直径。NS组大鼠于相应时间点给予等量无菌生理盐水进行注射,其余处理同上。应用SPSS13.0软件包进行统计分析,组内比较用ANOVA分析SNK检验,组间比较用T检验,P<0.05有统计学意义。结果(1)SCI后受损脊髓的组织学和微血管3D/2D形态学定量分析(1.1)组织学变化：(a)HE染色：SCI后1天,脊髓水肿,神经组织结构紊乱,细胞水肿,大量炎性细胞浸润,髓内出血及缺血区域呈梭型沿中央管扩张至头、尾两侧,病变累及灰白质,尤以中央灰质区严重。部分区域神经组织坏死,缺乏有效供血,神经实质丢失、缺损。损伤后14天,胶质细胞活跃,胶质瘢痕及空泡形成；(b)血管灌注厚组织切片观察：SCI后1天,髓内片状出血和缺血并存,血管断裂、坍塌。损伤后14天,出血吸收,缺血区域局限化,无血供,缺血周边由微血管包围、长入；(1.2)3D/2D形态学定量分析：(a)Micro-CT3D微血管形态观察：创伤后脊髓局部供血系统的完整性破坏,微小血管断裂、扭曲变形。损伤早期,VVF和Conn.D较正常组显著降低(p<0.05),M.Th和M.Sp则显著升高(p<0.05)。VVF在SCI后7和14天较1天组有明显的升高(p<0.05)；(b)2D血管形态观察：SCI后第1天,灰质前角区RECA-1阳性染色的微血管数目骤减(p<0.01),大量内皮细胞死亡。SCI后3和7天,微血管数目逐渐增多,但都远低于正常水平。(2)TMP对SCI后局部微血管3D形态学的影响：TMP组与NS组的3D容量性参数在SCI后的变化过程呈现相似趋势。TMP组的VVF在SCI后3、7和14天较NS组均明显增加,表明TMP显著提高了损伤段脊髓的血流灌注量(p<0.05)；M.Th在7天时显著增加(p<0.05)；Conn.D在7天时明显下降(p<0.05)；M.Sp在各时间点两组均无差异(p>0.05)；(3)TMP对SCI后局部微血管数目和直径的影响：TMP组与NS组微血管2D形态学参数在SCI后随时间推移呈现相似的变化趋势。在SCI后7和14天,TMP组的RECA-1阳性染色的微血管数目较NS组明显增多(p<0.05),微血管平均直径亦较NS组在SCI后1天时有显著增加(p<0.05)。结论(1)创伤直接导致大鼠急性脊髓损伤后血管网络结构性损毁和容量性减少；损伤后血管再生作为一种潜在的内源性机制,可帮助恢复受损脊髓的血运重建；(2)川芎嗪通过扩张微血管、增加血流灌注和促进血管再生改善大鼠受损节段脊髓的局部微循环。第三章川芎嗪对大鼠损伤脊髓VEGF和HIF-1α表达的影响目的探讨TMP对大鼠SCI后VEGF和HIF-1α表达的影响及其与血管再生的关系。方法SD大鼠共85只,其中5只大鼠只行椎板减压术,不予脊髓打击作为正常对照组(Sham组)。其余80只大鼠行改良Allen’s打击法制作急性脊髓损伤模型,然后随机分为TMP组(n=40)和NS组(n=40)。TMP组大鼠在术后30min开始给予腹腔注射TMP (200mg/kg),连续治疗5天(1、3天组分别给药至处死前),于术后1、3、7和14天取T1o段脊髓标本,分别利用Western Blot检测VEGF和HIF-1α表达水平；利用免疫荧光检测并定位VEGF表达；利用免疫组织化学检测并定位HIF-1α表达。一抗分别为兔抗大鼠anti-VEGF和兔抗大鼠anti-HIF-1α。半定量分析VEGF和HIF-1α的表达水平和表达定位。NS组大鼠于相应时间点给予等量生理盐水进行注射,其余处理同上。应用SPSS13.0软件包进行统计分析,组间比较采用T检验,P<0.05有统计学意义。结果(1) VEGF的表达及定位：VEGF蛋白在正常和急性SCI后的各个时间点的脊髓切片中均有阳性表达,呈弥散性分布于灰、白质区,且灰质区荧光光密度值高于白质区。VEGF在正常和损伤的神经元的胞核、胞浆和突起,以及神经胶质细胞、血管内皮细胞、神经传导束和室管膜细胞胞浆中均呈大量阳性表达。(2)TMP对VEGF表达水平的影响：VEGF在SCI后随时间的表达曲线呈波动状“S”形,即创伤后的第1天,VEGF蛋白的表达显著增高,3和7天时VEGF蛋白的表达水平下降,14天时再次升高。TMP组和NS组的VEGF在SCI后表达变化趋势相似。在SCI后的7和14天,TMP组的VEGF表达较NS组显著升高(P<0.05)；(3) HIF-1α的表达及定位：正常脊髓组织切片中鲜有HIF-1α的表达。脊髓损伤后,HIF-1α蛋白在神经元胞体、轴突和树突以及室管膜细胞胞浆中大量阳性表达,亦见部分神经胶质细胞、少突胶质细胞、血管内皮细胞和传导神经纤维中有阳性表达；(4)TMP对HIF-1α表达水平的影响：SCI的急性期,HIF-1α表达急剧升高,3天时达高峰。TMP能显著下调HIF-1α在损伤后各个时间点的表达(p<0.05),并维持其在低水平。结论(1)HIF-1α/VEGF低氧代谢途径参与了大鼠脊髓创伤后血管再生的过程；(2)川芎嗪能够有效的改善大鼠脊髓创伤后局部组织的低氧状态；(3)川芎嗪的促血管再生作用可能与非HIF-1α诱导途径的VEGF表达的增高有关。