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年龄相关性黄斑变性（AMD）是目前全球主要的致盲原因之一。脉络膜新生血管化（CNV）是AMD造成视力损伤的主要原因。贝伐单抗（Bev）作为内源性抗血管新生药物,是目前临床医生最常使用的抗血管内皮生长因子（VEGF）药物,临床上通过玻璃体腔注射方式给药。但是单独的Bev给药不足以完全阻断CNV的发展,且人眼一生所能承受的玻璃体注射次数有限,合理的联合用药可能会产生明显优于药物单一治疗的治疗效果。地塞米松（Dex）作为外源性抗血管新生药物,目前已是眼科临床常用药物。鉴于其常规给药方式口服或静脉的系统性毒副作用,以及眼球特有的血-房水屏障、血-视网膜屏障等屏障结构的存在,所以一般也选择玻璃体注射给药。但鉴于Dex代谢快以及玻璃体给药产生的疼痛和副作用,不宜频繁操作,因而开发合适的载体将减少Dex的给药频率并提高选择性。综上所述,开发一种作用时间长、效果更好的药物共递送系统具有重大的临床意义。AMD发病过程中VEGF表达显著增加,VEGF的过表达会诱导病理性新血管的形成。VEGF的分泌主要来自视网膜色素上皮细胞（RPE）,因此RPE细胞是AMD中减少VEGF表达和防止CNV形成的潜在靶点。在眼部新生血管形成过程中,整合素受体αvβ3在RPE细胞表面过度表达,环状RGD（cRGD）肽的αvβ3整合素亲和力特别高。聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）纳米粒作为一种新型的药物递送载体,具有生物相容性高,尺寸小,便于细胞摄取等优点。因此,具有cRGD靶向性的纳米药物共递送载体是一种有前景的AMD治疗方式。本研究主要包含以下三部分内容:1、药物体外分析方法建立及Bev稳定性研究本部分首先建立了Dex的体外分析方法,本方法在浓度为0200μg/mL的范围内,线性关系良好,该分析方法的专属性,准确度和精密度均符合要求。然后建立了Bev的体外分析方法,使用BCA蛋白浓度测定方法检测Bev浓度,绘制了浓度范围在0400μg/mL和01000μg/mL的标准曲线,线性关系表现良好,准确度和精密度均符合要求,并测得Bev的等电点为7.6左右。本部分还通过体积排阻色谱、圆二色谱和荧光光谱考察了Bev的体外结构完整性和稳定性,相比于目前广泛应用的化学交联体系,静电孵育体系能够更好地维持Bev的结构完整性和二级、三级结构稳定性。2、共载Bev和Dex的聚乙烯亚胺（PEI）阳离子纳米载体的制备及评价本部分以PLGA为纳米粒载体材料,并加入支链PEI调节纳米粒电位,制备包载Dex的DPPNs。通过静电吸附作用将带负电的Bev吸附到带正电的DPPNs表面制备了aBev/DPPNs。与此同时,将交联法作为对照方法制备得到cBev/DPNs纳米粒。通过考察PLGA含量、Dex含量、超声时间、PVA浓度、PEI含量、Bev含量和Bev与DPPNs孵育时间确定了aBev/DPPNs的最优处方为:Dex的质量为4 mg,PLGA的质量为20 mg,PVA水溶液浓度为0.5%（w/v）,PEI浓度为0.6%（w/v）,超声时间3 min,得到DPPNs。将10 mg Bev和10 mg DPPNs混合分散在4 mL pH 8.0的PBS中,上述混合体系在室温条件下孵育2 h得到aBev/DPPNs。优选处方的aBev/DPPNs粒径是217.7±5.3 nm,PDI是0.279±0.049,电位是0.85±0.37 mV,载药量是9.50±0.30%,包封率是56.97±1.93%,连接率是85.64±0.28%。Native-PAGE结果证明吸附法很好的保留了Bev结构完整性。扫描电子显微镜（SEM）结果显示纳米载体分散较均匀,球形度高。稳定性实验表明aBev/DPPNs在37℃的PBS中72 h内稳定性很好。在37℃的玻璃体液中,在72 h内粒径从207.7±3.8 nm减小到194.0±12.8 nm,玻璃体液中的多种蛋白和Bev的少量脱落对粒径造成了轻微的影响。体外释放实验显示,aBev/DPPNs中的Dex和Bev更完全的释放可以令药物更大程度的发挥疗效。然后我们进行了一系列细胞体外抗血管生成实验。在人脐静脉上皮细胞（HUVEC）的细胞凋亡实验、细胞迁移实验、细胞侵袭实验和细胞的小管形成实验中,aBev/DPPNs均表现出明显的抑制HUVEC细胞体外血管生成的能力,说明aBev/DPPNs对体外血管生成的各个阶段均具有显著的抑制作用（p<0.001）。在鸡胚绒毛尿囊膜实验（CAM）实验中,Dex、Bev、cBev/DPNs和aBev/DPPNs组的血管数量百分比分别为43.10±6.85%、42.98±6.57%、7.93±0.74%和4.43±1.55%。因此,aBev/DPPNs在体内CAM模型上显示出很强的血管新生抑制效果（p<0.001）。3、cRGD肽修饰的共载Bev和Dex的PEI阳离子纳米载体的制备及其在AMD中的研究本部分制备了以cRGD肽为靶头的共载Bev和Dex的PEI阳离子纳米载体。在处方优化实验中,我们在aBev/DPPNs的制备方法基础上通过考察cRGD-PEG-PLGA投入量确定了最优处方中PLGA和cRGD-PEG-PLGA的质量分别为18 mg和2 mg。优选处方aBev/cRGD-DPPNs的粒径是213.8±1.5 nm,PDI是0.153±0.036,电位是0.30±1.61 mV,载药量是9.35±0.41%,包封率是56.07±2.46%,连接率是83.15±1.66%。SEM结果显示该纳米载体分散较均匀,球形度高。稳定性实验表明aBev/cRGD-DPPNs在37℃的PBS中72 h内稳定性很好。在37℃的玻璃体液条件下,72 h内出现Bev的少量脱落及释放。体外释放实验显示,aBev/cRGD-DPPNs在168 h内Dex和Bev累积释放量为66.5±4.2%和56.3±4.8%。采用激光共聚焦显微镜（CLSM）实验和流式细胞术观察纳米粒在人视网膜色素上皮细胞（ARPE-19）和人肾胚细胞（293T）中的摄取情况。我们采用Rhod B和FITC标记纳米粒。实验结果均表明aBev/cRGD-DPPNs在ARPE-19细胞中荧光强度最强,说明aBev/cRGD-DPPNs具有最高的摄取率。而在293T细胞中,极少被摄取,进一步证明了aBev/cRGD-DPPNs的选择性。在HUVEC细胞的细胞凋亡实验、细胞迁移实验、细胞侵袭实验和细胞的小管形成实验中,aBev/cRGD-DPPNs均表现出明显的抑制HUVEC细胞体外血管生成的能力,说明aBev/cRGD-DPPNs对体外血管生成的各个阶段均具有显著的抑制作用（p<0.001）。在体内抗血管生成实验中,本研究首先通过激光诱导建立青紫蓝兔眼CNV模型,然后通过荧光血管造影（FFA）实验证明aBev/cRGD-DPPNs对眼底CNV荧光泄漏情况抑制最明显。组织病理学实验中,aBev/cRGD-DPPNs组CNV结构减少最明显。免疫组化实验中,aBev/cRGD-DPPNs组VEGF阳性表达的积分光密度值（IOD）最小。酶联免疫吸附实验（ELISA）实验中,aBev/cRGD-DPPNs组的RPE-脉络膜组织中VEGF含量相对最少。因此,aBev/cRGD-DPPNs在兔CNV模型上显示出很强的减少VEGF和抑制CNV的能力。此外,眼压检查证明了纳米粒的生物安全性。综上所述,本研究构建的具有cRGD肽修饰的药物共递送载体能够有效的将药物递送到AMD发病部位并发挥效果,Dex和Bev的联合用药能够更好的抑制CNV,是一种治疗AMD的理想载体。