【摘 要】
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即时检测（point-of-care testing,POCT）具有检测快速、操作简单、环境适应性强的特点,在体外诊断领域发挥着越来越重要的作用。开发高效、便携、低成本的检测设备和方法是目前即时检测的发展趋势。数字微流控（Digital microfluidics,DMF）是一种新兴的液滴操控技术,其能够实现在微电极阵列上对离散液滴进行精准操控,完成生物分析应用中的基础操作。数字微流控具有诸多优势
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即时检测（point-of-care testing,POCT）具有检测快速、操作简单、环境适应性强的特点,在体外诊断领域发挥着越来越重要的作用。开发高效、便携、低成本的检测设备和方法是目前即时检测的发展趋势。数字微流控（Digital microfluidics,DMF）是一种新兴的液滴操控技术,其能够实现在微电极阵列上对离散液滴进行精准操控,完成生物分析应用中的基础操作。数字微流控具有诸多优势:（1）试剂消耗小,使用成本低;（2）反应体积小,传热速率快,缩短反应时间;（3）通过电信号对液滴进行操控,可以自动化完成重复复杂的实验操作;（4）控制电路简单,仪器具有小型化和便携性的特点。因此数字微流控在即时检测应用方面具有很大的潜力。目前已有基于数字微流控的即时检测设备和方法被开发,但是其检测原理多数还是基于传统的生化反应（如ELISA,酶反应法等）,这些方法存在灵敏度低,耗时长等缺点。因此发展高灵敏度、操作简便的检测方法有助于推动即时检测领域的发展。CRISPR-Cas检测系统近年来受到广泛的研究,其中基于CRISPR-Cas12a系统的检测方法HOLMES和DETECTR具有高灵敏度、超高分辨率和耗时短的优点。Cas12a蛋白的反式切割活性赋予检测体系自信号放大的功能,并且整个检测过程可在等温环境下进行,这些特性使得CRISPR-Cas12a体系非常适合用于即时检测的应用开发,解决目前即时检测方法灵敏度低、操作繁琐等问题。但是目前CRISPR-Cas12a系统主要针对核酸靶标,只有少数针对非核酸靶标（如小分子、离子等）的检测方法。核酸适配体（Aptamer）是一段能够特异性结合非核酸靶标的寡核苷酸序列,其靶标种类多样,包括小分子、离子、蛋白、细胞、组织等。通过合理的设计能够利用核酸适配体构建将结合靶标的信号转换为核酸信号的生物传感器,利用生物传感器的信号转导功能可以实现Cas12a对非核酸靶标的检测。基于上述问题,本论文以发展基于CRISPR-Cas12a的非核酸靶标检测方法和基于数字微流控的高效自动化即时检测平台为主题,展开以下工作:（1）基于CRISPR-Cas12a的数字微流控即时检测平台为了解决目前数字微流控上传统生化方法检测灵敏度低、操作繁琐等问题,我们设计并制作了兼容CRISPR-Cas12a体系的数字微流控芯片,并在芯片上进行了Cas12a反式切割对核酸进行定量检测。为后续发展基于CRISPR-Cas12a的即时检测方法奠定基础。（2）基于CRISPR-Cas12a的小分子自动化检测方法为解决目前基于CRISPR-Cas12a的即时检测方法只能针对核酸靶标的问题,我们以ATP为模型小分子,设计了一个核酸适配体生物传感器。通过生物传感器将ATP小分子信号转化为核酸信号并被Cas12a蛋白识别和放大。同时结合数字微流控平台,提供了一种小分子即时检测的新思路。（3）基于CRISPR-Cas12a的疾病标志物自动化检测方法为了进一步拓展CRISPR-Cas12a的检测靶标范围,并探究数字微流控即时检测平台在疾病诊断方面的应用。我们在小分子自动化检测方法的基础上,进一步设计了针对蛋白靶标IFN-γ的核酸适配体生物传感器,并联合检测了相应疾病的其他生物标志物,为该平台在疾病即时诊断方面的应用做了可行性探究。
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