结构生物学作为现代生命科学的前沿和带头学科之一,在对生命现象与规律的研究中发挥着举足轻重的作用。结构生物学研究手段主要有X-射线晶体学,核磁共振波谱学（NMR）及冷冻电子显微学（Cryo-EM）等,每种方式都有其相应的特点。X-射线晶体学适用于分子量较小的蛋白质,需要蛋白质能够形成规则的三维晶体,利用晶体衍射数据解析得到三维结构。核磁共振波谱学可以测定不同溶液状态下的结构,用于研究分子的柔性、分子间的相互作用、分子的动态特征等,但是对于分子量的局限性很大,只适用于分子量比较小的蛋白质（<40-50 kDa）。相比之下,冷冻电镜技术不需要蛋白质结晶,且适用于分子量较大的蛋白质,因此成为研究生物大分子结构的首选。由于冷冻电镜成像技术及数据处理方式的发展,直接电子探测器、图像漂移校正算法及三维分类技术的出现,使得该领域取得了突破性进展。近两年涌现出了大批冷冻电镜高分辨结构,冷冻电镜逐渐成为结构生物学中最重要的研究手段之一。尽管冷冻电镜解析高分辨结构已经成为可能,但是对于如何进行结构解析,如何优化解析过程仍有许多问题需要解决。针对不同的研究对象,具体的结构解析方案也不尽相同,需要经过摸索和尝试才能找到最合适的方法解析得到高分辨结构。本论文建立和完善了有关高分辨冷冻电镜单颗粒的重构方法,尤其是螺旋体单颗粒重构方法。论文中首先对电子显微学成像原理及三维重构原理进行简单介绍。在此基础之上,以人源T4-γ-secretase及人源Rad51与DNA形成的螺旋纤维结构解析为例,详细阐述冷冻电子显微学高分辨结构解析如何进行。在结构解析过程中,进行了多种尝试,最终获得近原子分辨率结构,通过原子模型搭建及结构分析,为其生物学功能提供了结构基础,同时也为相应的生物学问题提供了结构依据。在人源T4-γ-secretase中解析得到了4.32?的结构,电镜结构揭示了γ-secretase四组分的组装机制,为后续γ-secretase的结构及功能研究提供了结构依据。在Rad51课题中,解析得到了pre-synaptic和post-synaptic复合物高分辨结构,获得了链间交换的可能中间态结构,为Rad51介导的DNA修复提供了结构基础。上述例子中,高分辨结构解析方法是根据样品摸索得到的,说明冷冻电镜高分辨结构解析仍需要进行方法学探索,冷冻电镜单颗粒重构方法研究具有重要意义。