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多肽越来越受到人们的重视,现今已被用于很多领域,例如生物技术、生物医药、多肽饲料以及日化美容行业等。多肽的分离纯化成为了多肽发展的关键。虽然多肽与蛋白质之间并无严格的界限,但绝大多数的多肽分子量,尤其是寡肽(例如本论文中的二肽)要远小于蛋白质。多肽链短,且其在分子构象上随环境变化很小,然而,多肽又不同于通常的小分子,多肽将各种不同的氨基酸残基以肽键连接起来,具有类似与蛋白质的一些性质,因此,多肽的极性、非极性、静电基团会随着环境的变化而发生改变。蛋白质和多肽的这些功能基团不仅包括不同数量、不同种类的氨基酸残基而且还包括了肽键的连接方式:C-末端和N-末端。氨基酸通过肽键将氨基酸连接在一起形成多肽和蛋白质时,一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基相互作用,蛋白或多肽的一端以氨基结尾,另一端以羧基结尾,以氨基结尾的称之为N-末端,另外一端以羧基结尾称之为C-末端。我们可以用液相色谱(liquid chromatography,LC)来区分两个多肽之间连接方式的差异。反相色谱法(reversed phase liquid chromatography,RPLC)由于具有高分离度而被广泛应用于多肽的分离纯化。所以研究多肽在色谱上的保留行为对多肽类物质的分离纯化以及多肽在液固界面上的吸附理论具有重要的意义。本论文主要研究了二肽苯丙氨酸-异亮氨酸(Phenylalanine-Isoleucine,Phe-Ile)和异亮氨酸-苯丙氨酸(Isoleucine-Phenylalanine,Ile-Phe)在反相色谱上的保留行为,Phe-Ile裸露Phe的N-末端,Ile-Phe裸露Ile的N-末端,论文内容可分为以下四章:第一章、绪论对于多肽的分离方法最有效的是色谱法,多种色谱模式都应用于多肽的应用研究与分离纯化,如离子交换色谱法(Ion exchange chromatography,IEC)、亲水色谱法(Hydrophilic interaction chromatography,HILIC)、混合模式色谱法(Mixed-mode chromatography,MMC)和反相色谱法(reversed phase liquid chromatography,RPLC)等。科学家提出了多种色谱保留模型来对溶质在色谱上的保留行为来进行解释,例如Synder等提出的经验公式,还有溶解度参数模型,溶剂色效模型,疏溶剂化模型,计量置换理论模型等。第二章、二肽在RPLC中的分离使用不同的RPLC柱对二肽Phe-Ile和Ile-Phe进行分离。本章研究了柱长、流速、梯度、温度等对二肽保留行为的影响,发现不同色谱条件对二肽保留时间差值At、峰宽w和分离度Rs的影响不同:1、两种二肽无论在梯度或等度条件下都能达到完全分离,并且Phe-Ile总是先出峰;2、在等度条件下,TR,Δt,w,和Rs都随着柱长增加而增加,这符合通常小分子的保留机理。而在梯度条件下,当柱长从5cm增加到25cm时,At几乎不变,w变窄;3、当流速从0.5mL/min增加到2mL/min时,At增大,w减小;4、当温度从10℃增加到50℃时,At几乎减小,w基本不变;5、当线性洗脱从15min增加到40min时,At和w都增大。Δt和w是影响分离度的主要因素,因此相比其他因素,流速对二肽分离度的影响最大。第三章、二肽在RPLC中的迁移机理首次发现二肽在RPLC中的“静-动”迁移现象。研究这二肽Phe-Ile和Ile-Phe在RPLC中梯度洗脱时的保留时间、进样时间与洗脱浓度的关系,发现二肽的在RPLC中的保留行为分为两部分:“静止”区域(steady region,SRN)和“迁移”区域(migration region,MRN)。在“静止”区域中,二肽是静止不动的,而在“迁移”区域二肽是移动的。SRN和MRN可以通过非同步进样实验测定的。SRN和MRN之间的临界点称之为临界迁移点TCMP点(critical migration time point,TCMP)。第四章、二肽在RPLC中的热力学研究在不同温度下测定其TCMP点以及二肽在RPLC上的迁移自由能ΔG,研究温度对“静-动”保留机理的影响。利用计量置换理论,测定二肽在不同温度下的计量置换理论参数log I与Z值。应用热力学参数焓变ΔH、熵变AS以及焓熵补偿解释了二肽在RPLC上的“静-动”保留现象。