优雅蝈螽myosin 7a基因克隆及其功能分析

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肌球蛋白(Myosin)是一类依赖于微丝的马达蛋白超家族,由N端的马达头部、颈部和C端尾部三部分组成。Myosin ⅦA是肌球蛋白Ⅶ家族的成员,在多种器官中表达,是一种“货物”转运蛋白。Myosin ⅦA也是纤毛和微绒毛的共同组成部分。优雅蝈螽(Gampsocleis gratiosa)在我国北方分布广泛,易于饲养,取材方便,是研究直翅目分子细胞生物学机制的良好材料。对优雅蝈螽Myosin ⅦA的功能分析不仅可以补充昆虫细胞发育研究的资料,还可以为直翅目昆虫生殖和消化排泄功能的研究及直翅目害虫的防治奠定分子基础。首先整理优雅蝈螽成虫转录组数据库,分析数据库中的肌球蛋白家族成员。以实验室前期测得的优雅蝈螽成虫转录组数据库为研究基础,从中检索肌球蛋白家族,利用NCBI Blastp在线比对,鉴定检索到的肌球蛋白。最终在转录组中鉴定出七种肌球蛋白基因,分别为:GgMyo1b、GgMyo5a、GgMyo6、GgMyo7a、GgMyo9a、GgMyo18a和GgMyo19。克隆GgMyo7a基因并对其进行生物信息学鉴定。GgMyo7a基因序列全长为8938 bp,含有1个编码1865个氨基酸的开放阅读框,分子量为216.18k D;GgMyosin ⅦA结构域:1个头部马达后紧随4个IQ基序的颈部;尾部结构域复杂,由2个重复的My TH4-FERM结构域串联构成,中间由SH3结构间开。GgMyosin ⅦA结构也与已知物种Myosin ⅦA结构一致。然后使用RNA干扰技术,对Myo7a进行mRNA水平的敲低。不同器官q PCR结果表明,Myo7a在精巢、消化器官(胃盲囊、中肠)及排泄器官(马氏管)的表达量较高。设计GgMyo7a目的片段对应的干扰片段,利用RNA干扰技术,将合成的Myo7a双链干扰RNA(dsmyo7a)进行体外注射。qPCR定量检测结果表明,dsmyo7a最适注射量为50μg;且注射dsmyo7a后,mRNA水平上,Myo7a的表达均下调,在第五天时Myo7a表达量最低,约下调80%。最后体外注射dsmyo7a,在细胞水平,通过石蜡切片H&E染色和PAS染色、冰冻切片免疫荧光染色、超薄切片铀-铅双染技术,观察分析RNA干扰后,敲低Myo7a目的片段后优雅蝈螽精子形成的影响,以及对消化道和马氏管上皮细胞微绒毛的影响。结果表明,优雅蝈螽精子形成八个时期中,干扰后的精细胞的细胞核、含有多糖类物质的顶体、微丝与微管均未观察到明显变化;干扰后的胃盲囊、中肠及马氏管上皮细胞微绒毛排布松散,边缘界限不连续;微绒毛单体的形态发生改变,膜也明显松散。同时,中肠的围食膜结构也遭到破坏。综合分析RNA干扰结果:RNA干扰后的消化道胃盲囊、中肠及马氏管上皮细胞微绒毛排布松散,边缘界限不连续,微绒毛单体形态发生改变。这表明Myosin ⅦA对消化道和马氏管上皮细胞微绒毛指状突起结构的维持有重要作用;透射电镜观察干扰后中肠上皮细胞微绒毛的横切面,发现微绒毛单体膜明显松散,进一步推测MYO7A可能是在微绒毛单体微丝与膜之间发挥作用。
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