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研究背景:类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种慢性、炎症性疾病。中性粒细胞在RA的发病机制中发挥着重要作用。细胞凋亡和中性粒细胞胞外诱捕网(Neutrophil extracellular traps,NETs)的释放是中性粒细胞程序性死亡的两个主要途径,二者通过不同的方式对炎症反应的放大或解除发挥着重要的调节作用。在RA中,延迟的中性粒细胞凋亡延长和放大了炎症反应;NETs及其组分的大量释放可能导致组织损伤和诱导自身抗体产生。大黄素是一种天然的蒽醌衍生物,存在于大黄、虎杖、何首乌和芦荟等许多广泛使用的中草药中,具有抗炎、抗感染和神经保护等药理作用。大黄素能否通过调节中性粒细胞活性来改善RA的症状及相关作用机制还有待深入研究。目的:本项研究的目的是评估大黄素在佐剂诱导的类风湿关节炎(Adjuvant-induced arthritis,AA)小鼠模型中的功效及其在调节中性粒细胞凋亡和NETs释放中的作用,为大黄素作为治疗RA的一个有效药物成分和临床应用提供实验依据。方法:1、通过AA小鼠关节炎模型,观察大黄素对RA的疗效;用小鼠踝关节石蜡切片的H&E染色和番红O固绿染色,评估大黄素对关节软骨的保护作用;采用CBA试剂盒,检测小鼠血清炎症因子的表达情况。2、采用免疫组织化学法,检测各组小鼠踝关节髓过氧化物酶(Myeloperoxidase,MPO)和中性粒细胞弹性蛋白酶(Neutrophil elastase,NE)的表达;用小鼠气囊炎模型、Transwell实验和实时荧光定量PCR实验评价大黄素对中性粒细胞迁移的影响。3、采用AnnexinV/PI双染法,检测大黄素对中性粒细胞凋亡的影响,用Western Blot检测细胞凋亡相关蛋白Bcl-2,Bax和Cleaved caspase-3的表达水平。4、用免疫荧光实验评估中性粒细胞胞外诱捕网的形成,及大黄素对MPO和NE释放的影响;采用免疫组织化学的方法观察小鼠踝关节肽基精氨酸脱亚胺酶4(Peptidyl arginine deiminase4,PAD4)的表达情况;用免疫荧光检测大黄素对中性粒细胞PAD4和瓜氨酸化组蛋白(CitH3)表达的影响。5、用免疫荧光和Western Blot检测大黄素对中性粒细胞自噬的影响。结果:1、大黄素能有效缓解AA小鼠的症状:1.1动物实验结果显示,AA模型组小鼠与正常对照组相比,踝关节直径和关节炎评分明显增高;大黄素治疗组踝关节肿胀程度明显减轻,踩关节直径(**p<0.01)和关节炎评分(**p<0.01)显著下降。1.2小鼠踝关节组织病理学分析:AA模型组小鼠踝关节与正常对照组相比出现典型的炎症表现,如炎性细胞浸润、软骨损伤和滑膜增生。大黄素治疗组的关节病理变化则得到明显改善,炎性细胞浸润减少,软骨的损伤、滑膜增生得到缓解。1.3大黄素对RA小鼠血清中炎性细胞因子TNF-α、IL-6和IFN-γ分泌的影响:经CBA法检测结果显示,小鼠血清中的TNF-α、IL-6和IFN-γ的含量,AA组小鼠与正常对照组相比有明显升高;而经大黄素腹腔注射治疗后,其含量均显著降低。2、大黄素抑制中性粒细胞的迁移:2.1大黄素抑制AA小鼠踩关节中MPO和NE的表达:经免疫组织化学分析,RA小鼠踝关节中MPO和NE的表达与正常组小鼠相比明显增多;大黄素治疗组MPO和NE的表达与RA小鼠相比则明显减少;2.2小鼠气囊炎实验显示,大黄素处理组可以逆转经LPS刺激后增多的白细胞总数(*p<0.05)和中性粒细胞数量(**p<0.01);2.3Transwell实验结果显示:大黄素处理组显著抑制fMLP刺激诱导的中性粒细胞的迁移(**p<0.01);2.4实时荧光定量PCR显示,大黄素呈剂量依赖性抑制经LPS刺激后上调的TNF-a、IL-6和IFN-y mRNA的表达。3、大黄素促进中性粒细胞的凋亡:3.1流式细胞术结果显示:大黄素可以逆转经LPS刺激导致的中性粒细胞凋亡减少(**p<0.01);3.2Western Blot结果显示:大黄素处理组与LPS刺激组相比,促凋亡的Bax和Cleaved caspase-3蛋白表达增多;抑制凋亡的Bcl-2蛋白表达减少(**p<0.01)。4、大黄素对NETs的影响:与PMA刺激组相比,大黄素明显抑制NETs的形成及MPO与NE的释放;小鼠踝关节免疫组化结果显示:AA组小鼠与正常对照组相比,PAD4阳性表达明显升高;经过大黄素治疗后,PAD4的表达显著下降;免疫荧光结果显示:大黄素可以降低中性粒细胞PAD4和CitH3的表达。5、大黄素对中性粒细胞自噬的影响:与PMA刺激组相比,大黄素明显抑制中性粒细胞自噬标志性蛋白LC3的表达;同时Western Blot结果显示,大黄素抑制自噬相关蛋白Beclin-1与ATG5的表达。结论:大黄素通过减少中性粒细胞浸润和促炎细胞因子(TNF-α、IL-6和IFN-γ)的释放有效缓解AA小鼠症状;大黄素可以逆转炎症信号诱导的中性粒细胞凋亡延迟;大黄素能够抑制中性粒细胞胞外诱捕网的形成;大黄素能够抑制中性粒细胞的自噬。研究结果表明大黄素可以通过调节中性粒细胞活性缓解RA症状,,为大黄素的临床应用提供了实验依据。