第一章文献研究第一节较系统地总结和归纳了国内外关于糖尿病发病机制、诊断方法和治疗方案等研究方面取得的进展,以期为糖尿病的深入认识以及临床治疗提供科学参考。第二节采用计算机对中医方剂数据库中关于治疗消渴症的方剂进行检索,应用Excel2010软件建立方剂数据库,收录每首组方中的单味药从而进行统计分析。采用关联规则方法对组方中药对以及药组的应用特点进行分析,从而探讨治疗消渴经方的用药规律与特点。第三节通过归纳与分析近年来国内外学者在糖尿病发病机制的认识、桑叶对其调节血糖的功效成分及其作用机制等方面取得的研究进展,以期为桑叶调控血糖及防治糖尿病并发症的作用机制深入研究提供指引,为桑叶资源的开发利用提供依据和参考。第二章桑叶多组分提取物的制备研究第一节干燥桑叶称重后,采用回流提取的方法,其工艺参数为：料液比1：40,溶剂为70%乙醇,提取时间45 mmin,提取2次,两次提取液过滤合并,减压浓缩至无醇味。选择AB-8型号的大孔树脂对粗提物进行纯化。桑叶提取物以2BV·h-1的流速上样,采用70%的乙醇以3 mL·min-1的流速进行洗脱,收集洗脱液,浓缩并冷冻干燥,进样分析。黄酮类成分含量为0.1%,酚酸类成分含量为0.4%,纯化后其含量分别为5.3%、10.8%。第二节干燥桑叶称重后,采用料液比1：12,回流1 h的提取方法进行提取,提取液采用80%醇沉24 h,上清液浓缩后在阳离子交换树脂上样,采用0.5mol·L-1的氨水以1.5 mL·min-1的流速进行洗脱,分别收集pH7-9.4, pH9.4-10.5, pH 10.5-13的不同pH段的洗脱液,浓缩,冷冻干燥得纯化的生物碱组分。DNJ主要集中在pH 7-9.4和pH 9.4-10.5两段,含量分别达到19.9%和39.4%。第三节干燥桑叶采用水提醇沉的方法对多糖类成分进行提取,得到桑叶粗多糖提取物。利用Sevage和AB-8大孔树脂纯化多糖,上柱溶液pH=8,用0.1 mg·mL-1的NaCl浓度以2mL·min-1的洗脱速度进行洗脱,收集洗脱液,冷冻干燥,得纯化的桑叶多糖组分。其中多糖含量由0.69%提高为18.9%。第三章采用葡萄糖氧化酶法,以蔗糖为底物,采用a-葡萄糖苷酶抑制模型对桑叶多组分进行评价；采用等效线法、周-特氏联合指数法和等辐射分析法评价两组分间的药效相互作用及量效特点,为揭示桑叶降血糖的作用机理提供科学依据。活性评价表明,桑叶黄酮、生物碱、多糖组分均具有显著的α-葡萄糖苷酶抑制活性,其抑制率随各组分浓度的增加而升高,3个组分中桑叶生物碱抑制活性最强。桑叶生物碱与桑叶黄酮配伍、桑叶生物碱与桑叶多糖配伍均表现出协同增效作用,但桑叶多糖与桑叶黄酮组配伍未见明显的协同作用。第四章采用网络药理学方法对桑叶治疗糖尿病的8种活性成分的分子作用机制进行分析,揭示其多成分-多靶点-多通路的作用特点及相关关系。网络分析表明,桑叶中8种活性成分共涉及47个靶点,63条通路。这些通路与神经-内分泌-免疫等相关,其中包括与糖尿病关联的胰岛素、MAPK、VEGF、Wnt、Jak-STAT等多条信号通路。第五章采用雄性SD大鼠灌胃桑叶生物碱、黄酮提取物,在不同时间点采集血浆样品,处理后进行检测。结果表明,槲皮素和山柰酚灌胃0.333 h后达到峰值,说明大鼠口服桑叶黄酮组分后吸收和分布迅速。服药后4h左右,两者第二次达到峰浓度,说明其在肠道内的停留时间较长,可能原因为体内存在肝肠循环。DNJ和Fagomine在胃肠道能较快地吸收入血,血药浓度在0.667h达到峰值,说明两者进入大鼠体循环后快速分布,发挥药效迅速。第六章采用超高效液相色谱串联四级杆飞行时间质谱(UPLC-QTOF/MS)技术结合多变量统计学分析,利用代谢组学的研究方法和技术探讨糖尿病模型小鼠血浆和尿液的整体代谢物谱特征、代谢轮廓变化和生物标志物群,并对桑叶生物碱、黄酮、多糖提取物干预后的生物效应转归与分子机制进行研究。结果表明,5组小鼠的血浆和尿液代谢物谱都得到了很好的区分,发现并鉴定了血浆中17个以及尿液中21个潜在生物标志物,血浆中生物标志物主要与缬氨酸,亮氨酸和异亮氨酸降解、色氨酸代谢和甘油磷脂代谢相关,尿液中生物标志物主要与苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸生物合成、苯丙氨酸代谢、烟碱和烟酸盐代谢、组氨酸代谢和鞘脂类代谢通路相关。这些代谢通路在糖尿病小鼠体内发生紊乱,而给予桑叶黄酮、多糖、生物碱组分后可使之逆转并向正常状态转归。第七章第一节采用肠道L细胞株GLUTag细胞为研究对象,研究AGEs对其细胞损伤、凋亡及炎症损伤的影响,在此基础上研究桑叶生物碱类、黄酮类、多糖类提取物以及单体DNJ和异槲皮苷干预后相应指标的变化,从而探讨其调节糖尿病的分子机制。结果显不,AGEs与RAGE结合后,可通过激活caspase-3、-9、诱导p53/Bax通路诱导肠道L细胞发生凋亡,同时激活NF-κB因子表达,释放TNF-a、IL-1、IL-6,从而使肠道L细胞产生炎症损伤。给予桑叶多组分后,各指标均向正常组回调,从而改善肠道L细胞炎症损伤,阻止细胞凋亡。第二节采用HepG2细胞为研究对象,优化胰岛素的作用浓度和作用时间,最终建立HepG2胰岛素抵抗细胞模型的最佳造模方法,在此基础上观察桑叶多组分对造模后的HepG2细胞葡萄糖吸收的影响。结果表明,胰岛素以3μg·mL-1作用48 h诱发的胰岛素抵抗效果最佳。桑叶生物碱、黄酮、多糖三个提取物和DNJ、异槲皮苷单体可以明显增加胰岛素抵抗细胞的葡萄糖消耗,桑叶生物碱、黄酮、多糖三个提取物和DNJ、异槲皮苷单体处理后再用胰岛素造模与造模同时给药的HepG2细胞,葡萄糖吸收与正常水平没有显著差异,提示桑叶多组分可在糖尿病的发生发展过程发挥作用。第三节采用前脂肪细胞株3T3-L1为研究对象,观察高糖诱导后对细胞分化、葡萄糖摄取、脂肪细胞因子mRNA的表达的影响,在此基础上研究桑叶生物碱类、黄酮类、多糖类提取物以及单体DNJ和异槲皮苷干预后相应指标的变化,从而探讨其调节糖尿病糖脂代谢的分子机制。结果显示,桑叶生物碱、黄酮、多糖组分及DNJ、异槲皮苷单体在低浓度时可促进3T3-L1前脂肪细胞的增殖,同时均可促进脂肪细胞分化关键因子PPARγ、C/EBPα、 SREBP-1的表达,从而促进脂肪细胞的分化和葡萄糖摄取、转运,提高脂肪细胞胰岛素敏感性,继而改善胰岛素抵抗。第四节采用肾小管上皮细胞株HK-2为研究对象,观察高糖诱导后对其ROS、NADPH氧化酶、ERK1/2水平的影响,在此基础上研究桑叶生物碱类、黄酮类、多糖类提取物以及单体DNJ和异槲皮苷干预后相应指标的变化,从而探讨其调节糖尿病肾病的分子机制。结果显示,高糖可诱导HK-2细胞的可增加HK-2细胞中的NOX1、NOX2、NOX4的表达,诱导细胞EMT。给予桑叶多组分后,各指标均向正常组回归,表明桑叶多组分可通过调节NADPH氧化酶来减少ROS的产生,阻止HK-2细胞转分化。