【目的】本研究拟在体外采用细胞因子联合不同小分子化合物扩增脐带血（cord blood,CB）来源的造血干细胞（hematopoietic stem cells,HSC）,探索体外诱导HSC高效扩增的最佳体系;通过免疫缺陷小鼠连续移植实验评价扩增后细胞的植入能力和长期自我更新能力;基于单细胞测序技术筛选调控HSC自我更新的关键分子,阐明其作用的信号通路,并从单细胞水平解析体外扩增体系对HSC自我更新和分化的影响。【方法】（1）CB来源的CD34⁺细胞在4种细胞因子（SCF、Flt3-L、TPO、IL-6）存在的条件下与UM171、SR1、和K1小分子单独或联合（USK）在无血清培养基中培养10 d,流式细胞术检测CD34⁺、CD34⁺CD38^-、CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺细胞的比例以及CD33⁺、CD41⁺、CD3^-CD56⁺、CD235a⁺、CD19⁺和CD3⁺细胞的比例;通过集落形成单位（colony forming units,CFU）实验评价扩增后的细胞向各系祖细胞分化的能力。（2）将500、2500及10000个未经培养的CB来源的CD34⁺细胞（Unculture）,或者500、2500及10000个起始细胞经Vehicle、USK体外培养10 d扩增后的细胞分别移植给首次移植NOD-Prkdc^scid Il2rg^null（NPG）受鼠,通过流式细胞术检测移植后5、8、12、16周时小鼠外周血和16周时骨髓中h CD45⁺的比例。（3）取首次移植10000个起始细胞组的NPG小鼠骨髓分为2×10⁶,5×10⁶和1×10⁷三个数量级分别移植给二次移植NPG受鼠,通过流式细胞术检测移植后16周时小鼠骨髓中h CD45⁺细胞的比例。（4）通过极限稀释分析（limiting dilution analysis,LDA）计算首次移植和二次移植小鼠体内NOD-SCID小鼠再植细胞（severe-combined immunodefcient mouse-repopulating cells,SRC）的数量。（5）采用单细胞RNA测序（single cell RNA sequencing,sc RNA-seq）技术从单细胞水平解析体外扩增体系对HSC分化的影响,筛选调控HSC自我更新的关键分子,阐明其作用的信号通路。【结果】（1）UM171、SR1、K1以及USK培养后CD34⁺细胞的比例均高于Vehicle培养组（P均<0.001）;USK以及UM171培养后CD34⁺CD38^-细胞的比例较Vehicle培养组明显升高（P均<0.001）,SR1及K1培养组与Vehicle培养组比较无统计学差异（P均>0.05）;USK培养后CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺细胞比例较Vehicle培养组明显升高（P<0.001）,其他组与Vehicle培养组比较无统计学差异（P均>0.05）。USK培养后CD34⁺细胞的比例与Unculture组比较无统计学差异（P均>0.05）,CD34⁺CD38^-细胞以及CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺细胞的比例均高于Unculture组（P均<0.05）。（2）USK培养组及SR1培养组CD34⁺细胞扩增的倍数较Vehicle组显著增多（P均<0.05）;UM171培养组CD34⁺CD38^-细胞扩增的倍数较Vehicle组升高（P<0.05）;Vehicle、UM171、SR1、K1、USK体外培养后CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺细胞的数量较培养前初始细胞数量分别增加了（61.58±47.51）、（248.56±193.44）、（210.05±201.46）、（133.08±118.93）和（543.33±365.20）倍,USK培养组CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺细胞扩增的倍数较Vehicle组显著增多（P<0.001）。（3）USK及SR1培养组CD3^-CD56⁺细胞比例均较Vehicle组增加（P<0.01）;UM171培养组CD33⁺细胞比例较Vehicle组增加（P<0.01）;UM171培养组CD41⁺细胞比例较Vehicle组降低（P<0.05）;各组之间CD235a⁺、CD19⁺和CD3⁺细胞比例均无统计学差异（P均>0.05）。USK、UM171、K1组CFU-G、M、GM、E以及GEMM的数量与Unculture组和Vehicle组比较均无统计学差异（P均>0.05）;SR1组CFU-G和GEMM的数量均较Unculture组减少（P<0.05）;Vehicle组GEMM的数量也较Unculture组减少（P<0.05）。（4）当移植500个起始细胞时,首次移植后第5周时USK组小鼠外周血中h CD45⁺细胞比例较Unculture组和Vehicle组均明显增加（P均<0.05）,移植后16周时USK组小鼠外周血和骨髓中h CD45⁺细胞比例与Unculture组比较无统计学差异（P>0.05）;当移植2500个起始细胞时,移植后5、8、12、16周时USK和Vehicle组小鼠外周血和骨髓中h CD45⁺细胞比例均较Unculture组明显降低（P均<0.05）。当移植10000个起始细胞时,移植后8、12、16周时USK组小鼠外周血中h CD45⁺细胞比例均较Unculture组减少（P均<0.05）。（5）当移植2×10⁶、5×10⁶或1×10⁷个起始骨髓细胞时,二次移植后16周时USK组以及Vehicle组小鼠骨髓中h CD45⁺细胞的比例与Unculture组比较均未见明显差异（P均>0.05）。（6）首次移植时USK组每个起始细胞中含有SRC的数量（1/279）较Vehicle组（1/1379）增加了约5倍（P<0.05）,较Unculture组（1/543）增加了约2倍（P>0.05）。二次移植时各组每个起始细胞中含有SRC的数量无统计学差异（P均>0.05）。（7）sc RNA-seq数据采用UMAP降维可视化后,共分为17个细胞亚群。比较CB来源的CD34⁺细胞经USK体外培养与Unculture细胞群的变化,结果显示:CD34⁺细胞经USK体外培养10 d时Cluster 4（HSC）、Cluster 16（My SC）以及Cluster 10（MESC）细胞数量较体外培养前显著减少或消失,Cluster 1（My RP）、Cluster 2（GMP）、Cluster 3（Granulocyte）、Cluster 5（EMP）、Cluster 6（Ma/Ba/Eo）、Cluster7（Monocyte/m DC）、Cluster 8（Platelet）、Cluster 15（Erythroid）的细胞数量增多;比较CD34⁺细胞经USK培养与Vehicle培养之间细胞群的变化,结果显示:USK体外培养后10 d时Cluster 10、Cluster 0、Cluster 1、Cluster 5、Cluster 6以及Cluster15细胞数量较Vehicle培养组增多,Cluster 3、Cluster 7、Cluster 8、Cluster 13以及Cluster 14（B/p DC）细胞数量较Vehicle组显著减少。（8）sc RNA-seq基因表达分析显示:除研究已报道的HSC特异性标记AVP以及与HSC“干性”相关转录因子KLF2、HES1、MLLT3之外,HOPX和ID1也表达于Cluster 4（HSC）和Cluster 16（My HSC）。（9）比较USK组与Vehicle组差异性表达基因结果显示:USK体外培养上调了NRIP1、PRDX1、SELENOW基因表达并下调了CYP1B基因表达。比较USK组与Unculture组差异性表达基因结果显示:USK体外培养后细胞周期和细胞增殖相关基因（MKI67、TOP2A、HIST1H4C和TUBA1B）、髓系基因（IGLL1和MPO）、线粒体基因（MT-ND1和MT-CO3）表达上调,转录因子JUN、JUND、FOS、FOSB、IRF1、REL和NFKBIA表达下调。（10）比较Cluster 0（Multi RP）、Cluster 1（My RP）、Cluster 2（GMP）、Cluster10（MESC）与Cluster 4（HSC）细胞群之间的差异性基因表达结果显示:富集的上调基因包括PCLAF、TYMS、CENPF、MPO、IGLL1、HIST1H4C、TESC和PGAM1,富集的下调基因包括JUN、JUND、FOS、FOSB、KLF2、IRF1、NFKBIA、HES1、DNAJB1、HSPH1、HSPA1A和PNRC1;GO分析结果显示Cluster 0、Cluster 1、Cluster 2、Cluster 10与Cluster 4比较主要是促进了线粒体氧化磷酸化能量代谢,抑制了细胞分化的负向调节以及细胞的黏附作用;Pathway分析显示:Cluster 0、Cluster1、Cluster 2、Cluster 10与Cluster 4比较正向调节了氧化磷酸化能量代谢通路,负向调节了MAPK信号通路、FOXO通路以及REG/GR通路。（11）采用SCENIC分析sc RNA-seq数据,结果显示:转录因子FOS、FOSB、JUN、JUND、IRF1、REL在Cluster 4（HSC）、Cluster 16（My SC）中调控强度较高;这些关键分子主要作用于HSC“干性”相关基因、核受体基因、FOXO家族、低氧相关基因、HOX家族、NF-κB信号、TGF-β信号、Notch信号、m TOR信号以及MAPK信号相关基因。【结论】（1）4种细胞因子（SCF+Flt3-L+TPO+IL-6）与3种小分子（UM171+SR1+K1）组合能够使表型为CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺的细胞体外扩增约543倍,其扩增效果明显优于4种细胞因子与其他单个小分子组合。（2）小分子化合物USK组合体外扩增的CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺细胞在NPG小鼠体内可以短期植入,但在长期植入方面与Unculture和Vehicle组比较未见优势,提示CD34⁺CD38^-CD45RA^-CD90⁺可能并不能作为具有长期植入能力的HSC标记。（3）CB CD34⁺细胞经USK以及Vehicle体外培养后HSC、My SC、MESC显著减少或消失,“再生祖细胞”数量增多;但是与Vehicle培养体系比较,USK体外培养使MESC和“再生祖细胞”数量增多,成熟细胞数量减少。表明CB CD34⁺细胞经USK以及Vehicle体外培养后HSC发生了不同程度的分化,但是USK扩增组比Vehicle扩增组的分化程度低。（4）HOPX和ID1有望作为人功能性HSC的表型标记。（5）FOS、FOSB、JUN、JUND、IRF1、REL是调控HSC自我更新的关键分子;通过促进转录因子FOS、FOSB、JUN、JUND、IRF1、REL的表达和调节HSC的代谢途径、线粒体功能和ROS水平可能有助于维持HSC的自我更新并抑制其分化。