长链非编码RNA-DHC在肝癌中的鉴定及功能研究

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研究目的:肝癌是指发生于肝脏的恶性肿瘤,是临床上最常见的恶性肿瘤之一。在目前已知的恶性疾病中,肝癌的发病率位居世界第六位,在太平洋沿岸及非洲东部这些高发地区,可以达到30/10万,而在澳洲、美洲等地发病率地区,也能达到5/10万左右。它的死亡率排在恶性疾病的第三位,达到20/10万,并且近10年来肝癌的发病率及死亡率呈缓慢上升的趋势。近年来,随着手术技术的不断更新、放化疗的普遍应用、靶向药物及例如免疫治疗等各种各样新型治疗技术的发展,肝癌的死亡率相对于以前已经有了很大改善,但肝癌患者的长期生存率、带瘤生存率及术后复发的情况仍然不够理想。这是因为在肝癌的发病早期,患者的临床症状并不明显,而当患者因为黄疸、乏力、腹水等症状去做相关检查时,往往才发现肝癌的存在。这时,往往已经失去了手术治疗的机会,癌细胞已经存在扩散,预后已经不甚理想。所以,肝癌如何能够早期发现、早期诊断、早期治疗是人们普遍关心的问题。对长链非编码RNA的研究为我们打开了新的思路,有很多文献证明,长链非编码RNA在人体的各种功能中都起到了重要的作用。本文的目的就是鉴定长链非编码RNA-DHC在肝癌的中的作用,探讨其在肝癌的演化过程中发挥作用的功能,评估其作为新的肝癌诊断与治疗靶点的可能性研究方法:在前期实验中,我们利用在东方肝胆外科医院进行手术的肝细胞癌患者的肝癌组织样本与癌旁组织样本进行了分析。发现,长链非编码RNA-AK123488(NCBI编号),我们将其命名为长链非编码RNA-DHC(Down-regulate in Hepatic Carcinoma,首字母缩写),在肝癌组织中有着明显的下调表达。这说明,肝癌的发生与发展对此长链非编码RNA的表达产生了重要的影响,或者,我们猜测,是否其在肝癌的发生发展中也起到了重要的作用。为了进一步研究LncRNA-DHC的功能,我们通过5’,3’-RACE的方法获得了LncRNA-DHC的全长序列并进行了PCR实验,验证了此长链非编码RNA在肝癌细胞中确实存在着低表达。接着我们又挑选出了85对有着完整的临床病理资料的患者,通过PCR的表达量分为高表达组和低表达组,并以此为基础,对LncRNA-DHC和患者的预后进行了生存分析。接着我们对LncRNA-DHC进行了初步的功能探索。敲低了LncRNA-DHC的表达,然后通过慢病毒转染的方式在肝细胞癌细胞株HCC LM3、SMMC-7721中干扰了LncRNA-DHC的表达。在培养形成稳转细胞系后,利用CCK-8实验检测了LncRNA-DHC在干扰前后对于肝癌细胞系体外增殖能力的影响。为了验证这种影响,我们接着构建了裸鼠皮下荷瘤模型,将稳转的敲低了DHC表达的细胞系及对照细胞系分别种入裸鼠双侧腋窝皮下。我们发现,敲低了LncRNA-DHC的细胞所形成的癌组织明显要比对照组增大更为明显。紧接着,我们利用同样的细胞系讨论了LncRNA-DHC对肝癌细胞的转移能力的影响,通过Transwell实验,我们发现敲低LncRNA-DHC的SMMC-7721细胞系有了显著增强的转移能力。研究结果:(1)LncRNA-DHC在癌组织的表达水平明显下调。(2)LncRNA-DHC与肝癌的子灶、微血管侵犯相关,也与手术病人的预后相关(3)在LncRNA-DHC高表达的细胞株HCC LM3、SMMC-7721中干扰LncRNA-DHC后CCK-8检测干扰前后细胞增殖能力的改变,发现LncRNA-DHC抑制肝癌细胞在体外的增殖迁移能力。(4)Transwell实验发现敲低LncRNA-DHC的SMMC-7721和HCCLM3细胞系有了显著增强的转移能力结论:LncRNA-DHC在肝癌组织中低表达,并且与肝癌的子灶、微血管侵犯相关,也与手术病人的预后相关,干扰LncRNA-DHC能影响肝癌细胞的增殖和侵袭能力。
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