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目的:一、通过观察中药单体成分白藜芦醇对BV-2小胶质细胞A β吞噬作用和炎症因子分泌的影响,及其对Trem2蛋白表达及分泌的调节作用,探讨白藜芦醇作为抗AD药物研发的可能性。二、通过观察过表达PS1对BV-2小胶质细胞吞噬作用的影响及其对Trem2转运的调控,探讨以PS1为间接作用靶点调控Trem2的转运,增强小胶质细胞对A β的吞噬,为抗AD中药的筛选提供更多的思路。方法:一、白藜芦醇对BV-2细胞吞噬作用的调控及其机制研究1.CCK-8检测细胞活力:选取白藜芦醇5μM、10μM、20μM、40μM为干预浓度,24小时或48小时后,加入CCK-8试剂,37℃C孵育2小时,在酶标仪中492nm处读取96孔板吸光值。2.流式细胞术:对BV-2细胞进行不同的干预之后,加入荧光标记的A β孵育2小时,流式细胞仪检测细胞荧光强度来测定BV-2细胞对于Aβ的吞噬作用。3.分子生物学实验:对BV-2细胞进行不同的干预之后,采用Western blot检测BV-2细胞Trem2总蛋白表达及上清中sTrem2的分泌量,采用Real-time PCR检测细胞IL-1 β、TNF-α的mRNA转录水平。二、PS1对BV-2细胞吞噬作用的调控及其机制研究1.分子生物学实验:用免疫共沉淀方法检测PS1与Trem2的蛋白间相互作用,以细胞膜表面生物素化的方法检测过表达PS1对BV-2细胞内Trem2蛋白转运的影响。2.载体病毒感染:采用病毒感染的方法对构建BV-2细胞的稳定转染细胞系。3.流式细胞术:采用流式细胞术检测PS1过表达对于BV-2细胞A β吞噬作用的影响。结果:一、白藜芦醇对BV-2细胞吞噬作用的调控及其机制研究1.在干预24小时的条件下,5 μM、10 μM、20 μM浓度组白藜芦醇与各自的空白对照组比较,对于BV-2细胞活力的影响均无明显的差异(P>0.05),40μM浓度组可降低BV-2细胞的活力(P<0.05)。而在干预48小时的条件下,5μM、10μM浓度组对于BV-2细胞的活力仍然没有影响(P>0.005),20 μ M、40 μ M浓度组可降低BV-2细胞的活力(P<0.05)。2.5 μM的白藜芦醇对于BV-2细胞的吞噬作用略有促进,但相比于对照组,差异不具有统计学意义(P>0.05);10 μM、20 μM浓度组相对于对照组显著促进吞噬作用,并且相比于对照组具有统计学差异(P<0.05)。3.白藜芦醇10uM剂量组BV-2细胞的Trem2蛋白表达量略有升高,但与对照组比较尚不具有统计学差异(P>0.05);20μM剂量组可明显升高Trem2蛋白表达量,相对对照组表达量约为后者的1.7倍,且差异具有显著的统计学意义(P<0.01)。4.白藜芦醇10 μ M剂量组可一定程度上抑制小胶质细胞sTrem2的分泌,但与对照组比较,差异尚不具有统计学意义(P>0.05);20μM剂量组可明显抑制sTrem2的分泌,相对对照组的分泌量为后者的70%左右,且差异具有显著的统计学意义(P<0.01)。5.Trem2-Fc4nM、20nM剂量组与相应浓度Fc对照组比较,BV-2细胞对Aβ的吞噬作用略有降低,但无统计性差异(P>0.05);而40nM剂量组与相应浓度对照组比较,BV-2细胞对A β的吞噬作用明显降低,且差异具有统计学意义(P<0.01)。6.不同剂量的白藜芦醇干预炎症反应模型BV-2细胞后,白藜芦醇各个剂量组均可降低细胞IL-1β的mRNA水平,且差异均具有统计学意义(P<0.05)。白藜芦醇对TNF-α的mRNA转录具有一定的下调作用,但是各剂量组相对对照组差异不具有统计学意义(P>0.05)。二、PS1对BV-2细胞吞噬作用的调控及其机制研究1.Trem2可以共沉淀PS1全长蛋白、PS1-NTF和PS1-CTF,而IgG对照组并没有检测到相应蛋白条带。反向的验证也证明,PS1-NTF抗体与PS1-CTF抗体的免疫沉淀物中,均可检测到Trem2的表达,而IgG对照组并没有出现相应的蛋白条带。2.BV-2-Vector组与BV-2-PS1组Trem2的蛋白总表达量基本一致,不存在差异性。细胞膜Trem2与总Trem2比值的结果分析表明,BV-2-PS1组比值相对BV-2-Vector组明显下降,且该差异具有统计学意义(P<0.05)。3.BV-2-PS1细胞系对于FAM-A β的吞噬明显低于BV-2-Vector细胞系,且差异具有统计学意义(P<0.05)。BV-2-PS1-Trem2细胞系相比BV-2-PS1细胞系对于FAM-Aβ的吞噬明显增加,且差异具有统计学意义(P<0.05)。结论:一、白藜芦醇对BV-2细胞吞噬作用的调控及其机制研究1.白藜芦醇干预可以促进BV-2细胞的吞噬功能,并且该促进作用存在剂量依赖性。2.白藜芦醇可上调细胞Trem2总蛋白的表达,下调sTrem2的分泌。3.白藜芦醇调节BV-2细胞吞噬功能的可能机制为上调细胞Trem2的表达和下调sTrem2的分泌。4.白藜芦醇可显著降低A β诱导的BV-2细胞IL-1 β的分泌,对TNF-α的分泌也有一定的下调作用,但结果无统计学意义,需要进一步探讨。二、PS1对BV-2细胞吞噬作用的调控及其机制研究1.PS1与Trem2之间存在蛋白间相互作用。2.过表达PS1可减少BV-2细胞的Trem2膜转运。3.过表达PS1可降低BV-2细胞的吞噬,在此基础上进一步过表达Trem2可恢复吞噬功能至基线水平,说明PS1降低BV-2细胞吞噬功能的机制为减少了 Trem2的膜转运。