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目的:脂肪组织在为身体提供绝缘、缓冲和美观方面起着至关重要的作用。因创伤、先天性缺陷、手术切除、疾病导致软组织缺损,需要促进其修复和再生。目前脂肪组织移植具有供区发病率高、供体短缺和免疫相容性等局限性。如何进行创伤修复与再生,改善损伤组织和器官功能是目前脂肪组织工程研究的重点。脂肪组织的早期生成和长期存活与血管生成相关,血管生成和脂肪生成之间存在密切的相互关系,尤其是在脂肪组织的早期发育中,脂肪生成与血管生成密切相关。脱细胞基质具有天然ECM（细胞外基质）成分、良好的生物相容性和低免疫原性。因此本研究希望开发一种可注射的复合水凝胶,利用Adv（Decellularized aortic adventitia,血管外基质）和SIS（Decellularized small intestine submucosa,小肠黏膜下层）的促血管生成作用,以及DAT（Decellularized adipose tissue,脂肪脱细胞基质）的促脂肪生成作用,构建血管化的组织工程化脂肪,并使用京尼平交联增强其生物力学性能。评估材料的脱细胞效果,以及理化性质。1.评估材料的交联效果,以及体外降解率。2.通过细胞毒实验、细胞增殖实验评估材料的细胞亲和性和体外的生物相容性。3.通过内皮细胞迁移实验和管形成实验评估材料的体外血管生成效果4.通过体外诱导脂肪干细胞成脂分化实验评估材料的体外脂肪再生效果5.通过将材料注射植入大鼠背部皮下,检测材料的体内免疫反应及脂肪再生和血管生成效果。方法:使用温和的脱细胞方法对新鲜脂肪组织,小肠黏膜下层,血管组织进行脱细胞处理,并通过对新鲜组材料和脱细胞组材料进行HE染色、DAPI染色、油红O染色、DNA定量验证材料的脱细胞效果。对干重情况下的新鲜组材料和脱细胞组材料的胶原蛋白含量和糖胺聚糖含量进行检测,以此检测脱细胞方法对于组织的胶原蛋白和糖胺聚糖的影响。通过对交联后的水凝胶进行茚三酮测定,以此检测水凝胶的交联度。通过对干重水凝胶在不同时间段的重量测定,检测水凝胶的降解情况。通过倾倒实验,对不同时间段水凝胶的凝胶化情况进行测定。通过细胞毒实验、细胞增殖实验检测材料的细胞亲和性和体外的生物相容性。通过内皮细胞迁移和管形成实验检测材料的体外成管效果。体外进行诱导脂肪干细胞的成脂分化,通过油红O染色检测材料的体外成脂效果。将复合水凝胶植入大鼠背部皮下,然后进行HE染色、油红O染色和免疫组化染色,检测移植物体内免疫反应及成脂、血管生成效果。结果:HE染色、DAPI染色结果显示脱细胞基质组织切片中未见到细胞核。DNA定量结果显示,脱细胞材料的DNA含量均小于50ng/mg。油红O结果显示,脱脂后的脂肪组织材料无脂滴残留。以上结果表示,材料脱细胞完全。胶原蛋白定量检测和糖胺聚糖的定量检测的结果显示,脱细胞材料和新鲜组织之间的胶原蛋白含量和糖胺聚糖含量差异没有统计学意义（P＞0.05）。茚三酮测定结果显示,京尼平交联后,水凝胶中游离氨基酸显著减少（P＜0.01）。凝胶时间测定显示,37℃环境下,不同浓度的水凝胶在0min时均呈流动状态;25min时,除浓度为2mg/ml的水凝胶外,都已经凝胶化。降解结果显示,与DAT、SIS、Adv凝胶相比,DAT g（京尼平交联的DAT水凝胶）、SIS g（京尼平交联的SIS水凝胶）、Adv g（京尼平交联的Adv水凝胶）的降解率显著降低。其中,DAT g降解率最低,4周时降解率＜25%,而未交联水凝胶降解率均＞90%。由此可见,使用京尼平交联后,水凝胶降解率显著降低（P＜0.01）。将与材料共培养1天、3天、5天后的细胞进行AO/PI染色后,将孔板放在荧光显微镜下进行拍摄,可见细胞存活良好,未见细胞死亡,证实水凝胶对细胞没有毒性作用。划痕实验结果显示,DAT+SIS 1:1组和DAT+Adv 1:1组划痕愈合面积显著增加,证明这两组促内皮细胞迁移能力好。材料与脂肪干细胞共培养,成脂诱导7天后进行油红O染色,通过对比可以得出DAT+SIS 1:1和DAT+Adv1:1组脂滴最为明显,成脂效果最好。根据以上实验结果结果。我们得出DAT与SIS或Adv 1:1复合组有效的促进了h ADSCs的成脂分化。体内取材后的HE染色显示DAT与SIS或Adv 1:1复合组促进h ADSCs生长与成脂分化,有脂肪细胞生成,材料周围组织有细胞浸润,各组可见血管生成以及不同程度的成脂分化。1周和6周时,各组均可以看到早期的血管生成,其中DAT与SIS或Adv 1:1复合组血管生成最多。取材后油红O染色结果显示,1周时,DAT与SIS复合组,按1:1比例复合组的脂肪生成效果优于2:1和3:1的复合组也优于单纯的DAT组;DAT与Adv复合组,按1:1比例复合组的脂肪生成效果优于2:1和3:1的复合组也优于单纯的DAT组,而单纯血管脱细胞基质组（Adv）脂肪生成效果最差。6周时,DAT与SIS复合组,1:1比例复合的脂肪生成效果强于2:1复合组和3:1复合组,而3:1复合组与DAT组差异不大;DAT与Adv复合组,1:1比例复合的脂肪生成效果强于2:1复合组和3:1复合组,而3:1复合组与DAT组差异不大。而单纯血管脱细胞组的脂肪生成效果最差。而6周时1:1复合组与2:1复合组差别不大,这可能与SIS及血管脱细胞基质的降解较DAT更快有关。免疫组化染色结果显示,1周时,DAT与SIS1:1复合组和DAT与Adv 1:1复合组CD31高表达,明显强于DAT组,与SIS和Adv组无明显差异。6周时,DAT与SIS 1:1复合组CD31阳性率最高,DAT与Adv1:1复合组CD31高表达,明显强于DAT组,与SIS和Adv组无明显差异。表示DAT与SIS或Adv 1:1复合组可促进血管生成。免疫组化染色结果显示,1周时,DAT与SIS 1:1复合组和DAT与Adv 1:1复合组CD68高表达,明显强于DAT组,与SIS和Adv组无明显差异。6周时,DAT与SIS 1:1复合组和DAT与Adv 1:1复合组CD68高表达,明显强于DAT组,与SIS和Adv组无明显差异。CD68染色结果与CD31一致,表示DAT与SIS或Adv 1:1复合组在早期和6周时成血管效果较单纯DAT组强,尤其在早期,复合材料组的成管效果明显优于单纯DAT组。免疫组化染色结果显示,1周时,DAT与SIS 1:1复合组和DAT与Adv 1:1复合组CD163高表达,明显强于DAT组,与SIS和Adv组无明显差异。6周时,DAT与SIS 1:1复合组和DAT与Adv 1:1复合组CD163高表达,明显强于DAT组,与SIS和Adv组无明显差异。CD163染色结果与CD31和CD68一致,表示DAT与SIS或Adv1:1复合组在早期和6周时成血管效果均比单纯DAT组强,尤其在早期,复合材料组的成管效果明显优于单纯DAT组。结论:通过细胞毒实验、细胞增殖实验证明材料无细胞毒性且具有良好的生物相容性;DAT与SIS或Adv 1:1复合组血管生成效果和脂肪再生效果好于其他组。