裸燕麦总蛋白、谷蛋白酶解物的功能特性及其抗氧化活性研究

来源 :内蒙古农业大学 | 被引量 : 11次 | 上传用户:hello_junz
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本文以裸燕麦为原料,采用碱法和Osborne法提取总蛋白和谷蛋白。筛选适宜的蛋白酶进行酶解制备抗氧化活性肽,并测定酶解物的功能特性。利用5种不同的体外抗氧化测定方法考察蛋白酶解物的抗氧化活性。通过阳离子交换层析和反相液相色谱相结合的方法对裸燕麦谷蛋白酶解物进行分离纯化。采用质谱法对纯化得到的抗氧化活性肽进行分子量和一级结构鉴定,结合氨基酸组成分析得到裸燕麦谷蛋白抗氧化肽的氨基酸序列,为裸燕麦酶解肽的进一步应用提供理论依据。主要研究结果如下:以裸燕麦总蛋白和谷蛋白为底物,分别采用碱性蛋白酶、胰蛋白酶、复合蛋白酶在各自适宜的条件’下进行水解,以水解度和羟白由基(·OH)清除率为指标考察酶解效果。结果表明裸燕麦总蛋白与谷蛋白均在碱性蛋白酶Alcalase的作用下,其水解度与-OH清除率较高。通过单因素和正交试验优化水解工艺条件,总蛋白最优酶解条件为:底物浓度10g/L,酶用量10%,pH值9,温度60℃,该条件下制备的裸燕麦总蛋白水解度达40%以上,·OH清除率达50%以上;谷蛋白最优酶解条件为:底物浓度10g/L,酶用量7.5%,pH8.5,温度55℃,该条件下制备的裸燕麦谷蛋白水解度近40%,·OH清除率达60%以上。研究了裸燕麦总蛋白与谷蛋白及其酶解物的功能特性,其中包括持水性、吸油性、溶解性、起泡性及泡沫稳定性、乳化性及乳化稳定性等指标。其酶解物的持水性和吸油性均比原蛋白有所降低。其酶解物均具有良好的溶解性,在弱碱性环境下可达到较高的溶解度。裸燕麦总蛋白与谷蛋白及其酶解物的起泡性和起泡稳定性在NaCl溶液浓度适当时得以提高,然而乳化性降低,乳化稳定性则提高。裸燕麦总蛋白与谷蛋白及其酶解物的起泡性和乳化性随蔗糖浓度的升高而降低,泡沫稳定性和乳化稳定性却随蔗糖浓度的升高而增加。采用5种体外抗氧化检测方法测定了不同浓度下裸燕麦总蛋白酶解物与谷蛋白酶解物的抗氧化活性。结果表明裸燕麦总蛋白酶解物与谷蛋白酶解物的浓度与其抗氧化活性呈现一定的量效关系。裸燕麦总蛋白酶解物与谷蛋白酶解物是良好的氢供体和电子供体,具有清除OH、O2·-、DPPH和过氧化氢的能力,还原能力也较好。通过离子交换层析分离纯化裸燕麦总蛋白酶解物得出的5个组分中,碱性组分E的·OH与DPPH·青除能力最强,IC50分别为1.79mg/mL和1.54mg/mL。从谷蛋白酶解物分离纯化的4个组分中,碱性组分D的.OH与DPPH.清除能力最强,IC50分别为1.53mg/mL和1.28mg/mL。谷蛋白组分D通过半制备型液相色谱进一步分离,得到2个组分,其中组分D-1的抗氧化活性较高。进而采用分析型液相色谱对组分D-1进一步分离纯化,得到1个主要组分D-1a,其清除.OH的IC50值为0.68mg/mL。经RP-HPLC鉴定为单一峰。裸燕麦谷蛋白酶解物经离子交换层析和RP-HPLC分离纯化后其清除自由基作用大幅度提高。D-1 a经氨基酸组成分析发现此抗氧化肽含有7个氨基酸,其中包含疏水性氨基酸His和Pro,芳香性氨基酸Tyr,非极性脂肪族氨基酸Ala;对其抗氧化活性起着重要作用。经过MALDI-TOF-TOF质谱分析鉴定抗氧化活性肽D-1a的相对分子量为785.38 Da,氨基酸序列为HYNAPAL (His-Tyr-Asn-Ala-Pro-Ala-Leu)。
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