硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)是继一氧化氮(nitric oxide, NO)与一氧化碳(carbon monoxide, CO)之后,逐渐被人们所公认的第三类气体信号分子,它是一种具有臭鸡蛋气味的无色小分子气体,在体内多个系统中广泛存在。近年来,大量文献证实H2S能够增加神经元的还原活性,具有抗氧化应激的功能,最终对神经元起到保护作用。本课题组已在整体动物实验水平上证实：H2S能够抑制SHR大鼠延髓RVLM区NADPH氧化酶的活性,引起超氧阴离子等活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平的减少,产生降低血压和减慢心率的心血管效应。在此基础上,本工作主要从细胞分子水平的角度探讨H2S如何抵抗延髓神经元胞内高ROS水平所导致的氧化应激作用。本实验首先采用免疫荧光法来检测CBS是否能够在原代培养的延髓神经元上表达,结果显示：CBS在延髓神经元上表达,该实验结果为研究中枢H2S的生理效应提供了结构基础。本工作采用DHE荧光探针法检测延髓神经元胞内的ROS水平,寻找出Ang Ⅱ致使延髓神经元胞内的ROS水平升高的适宜浓度及时间点,并选用CCK-8法测定神经元的活性。结果显示：单独给予Ang Ⅱ(终浓度为100nmol/L)可明显升高延髓神经元的ROS水平(P<0.01),且该浓度Ang Ⅱ对神经元的活性并没有影响(P>0.05),排除该浓度Ang Ⅱ对延髓神经元的毒副作用。在AngⅡ引起延髓神经元高ROS水平的基础上,再给予适宜浓度的NaHS,结果显示：50μmol/L,100gmol/L及200μmol/LNaHS都可显著抑制Ang Ⅱ引起的延髓神经元ROS水平的升高,其中100μmol/LNaHS作用较明显(P<0.05),但单独给予延髓神经元此浓度NaHS,神经元的ROS水平变化不大伊>0.05),无统计学意义。为探讨H2S抑制Ang Ⅱ引起的延髓神经元ROS水平的升高与何种信号通路有关,我们采用western blotting的方法法检测神经元MAPK家族的蛋白磷酸化水平,即检测p-ERK1/2、p-p38及p-JNK蛋白的表达量。首先,我们先确定Ang Ⅱ引起的延髓神经元p-ERK1/2蛋白磷酸化水平增高的最适宜的时间点,再给予100μmol/LNaHS,观察此浓度的NaHS能否抑制Ang Ⅱ引起的延髓神经元p-ERK1/2蛋白磷酸化水平的增高。结果显示：单独给予Ang Ⅱ(终浓度为100nmol/L)引起延髓神经元的p-ERK1/2蛋白发生快速磷酸化,最早作用出现在给药后5min,10min,15min,30min,但1h后不再改变,其中5min磷酸化的程度最高(P<0.01)；100μmol/LNaHS预处理神经元30min后,可以显著降低Ang Ⅱ(终浓度为100nmol/L)作用于神经元5min时引起的p-ERK1/2蛋白快速磷酸化表达(P<0.05)。为进一步验证H2S抑制Ang Ⅱ引起的延髓神经元ROS水平升高与p-ERK1/2蛋白有关,我们选择p-ERK1/2蛋白的抑制剂PD98059预处理延髓神经元,再给予神经元Ang Ⅱ(终浓度为100nmol/L),结果显示：PD98059可以显著降低Ang Ⅱ引起的延髓神经元ROS水平升高(P<0.01),从而进一步证实H2S抑制Ang Ⅱ引起的延髓神经元ROS水平升高与p-ERK1/2蛋白有关。同时本工作也检测延髓神经元p-p38蛋白的表达量,结果显示：100μmol/LNaHS预处理神经元30min后,可以显著降低Ang Ⅱ(终浓度为100nmol/L)作用于神经元30min时引起的p-p38蛋白快速磷酸化表达(P<0.01),该结果提示了p-p38蛋白也可能参与介导了H2S抑制Ang Ⅱ引起的延髓神经元ROS水平升高；但是单独给予Ang Ⅱ(终浓度为100nmol/L)后,延髓神经元的p-JNK蛋白的表达量没有变化(5min,15min,30min,60min)(P>0.05),初步提示了H2S显著抑制Ang Ⅱ引起的延髓神经元ROS水平的升高可能与p-JNK蛋白无关。为进一步研究H2S抑制Ang Ⅱ引起的延髓神经元ROS水平升高是否与NADPH氧化酶有关,本实验采用Real time PCR检测NADPH氧化酶亚单位p47phox与p67phox的mRNA水平。结果显示：H2S可以显著降低Ang Ⅱ引起的延髓神经元NADPH氧化酶亚单位p47phox与p67phox mRNA表达水平的升高(P<0.05)。综上所述,本工作提示H2S能够显著抑制Ang Ⅱ引起的延髓神经元ROS水平的升高,其作用机制包括两方面：(1)与MAPK家族中p-ERK1/2,p-p38蛋白表达有关,可以通过降低其表达量,从而产生抗氧化应激的作用；(2)与NADPH氧化酶亚单位p47phox, p67phox可能有关,通过降低其mRNA表达量,从而抑制NADPH氧化酶活性,减少ROS生成。