细胞间具有异质性。单个细胞表现出来的行为和特征,以及不同细胞间的差异性,在一些关键的生命过程中,如在癌症病变、胚胎发育、神经系统发育上具有重要的研究意义。单细胞分析以单个细胞的分辨率阐述细胞与细胞间关键性质（例如基因组、转录组、蛋白组、表观遗传组等）之间的差异,以揭示细胞的异质性特点,为疾病进程、亚型分类、谱系示踪、图谱绘制等分析提供重要方法。然而,当前的单细胞分析方法存在单细胞分离困难、细胞利用率低、分析通量低、测量灵敏度准确度不佳、成本高、数据整合复杂等问题。微流控技术的发展大大提高了单细胞分离与操控效率。其拥有纳升甚至皮升级的反应体积,与单细胞体积相适应,且具有反应起始浓度高,试剂消耗量小的优点。另外,测序技术的进步,例如第二代测序技术的出现,大大降低了测序的成本,结合生物信息学技术的发展,进一步推动了单细胞的组学分析。本论文通过结合微流控的高效细胞操控技术及高通量测序技术,开发了一系列高效、灵敏、准确、低成本的基于微流控的单细胞测序新方法,并开展了一系列生物医学应用。包括:1.发展了一种基于皮升级配对腔体的高通量单细胞转录组测序新方法通过将高效单细胞捕获操控微流控芯片与DNA编码技术相结合,一次测序即可完成对成百上千个单细胞转录组的同时分析,以实现高通量的单细胞异质性分析。通过设计一种基于差异流阻原理及微阀微泵控制的单细胞/单微球捕获与操控的微流控芯片,实现对痕量细胞样本的高效单细胞捕获;结合DNA编码技术,使每个细胞内的基因带上独一无二的细胞标签和分子标签,实现对大量单细胞同时测序;集成微阀微泵结构,实现微量反应体系的主动快速混合、交换以及对单细胞的清洗,提高细胞的裂解效率并有效地清除了溶液中背景游离RNA;利用皮升级单细胞反应腔体极大地提升了 RNA分子的局部浓度,实现痕量RNA分子的高效捕获与反转录扩增,提高了方法的基因检测灵敏度。与其它单细胞测序平台相比,在相同的测序深度下,该方法可以检测到更多的基因,极大地降低了测序成本。基于以上系列创新的设计,该方法具有细胞利用率高、灵敏度高和测序成本低的优势。利用该平台,本论文成功地在单个细胞水平上揭示了干细胞的分化发展规律,同时解析了癌细胞的耐药应答机制,展现了所发展的新方法在高通量单细胞异质性分析中的重要应用潜能。2.构建了一种高通量单细胞转录组和蛋白质组学联合测序新方法结合微流控技术、蛋白标记技术、编码微球技术和测序技术,构建了一种高通量单细胞转录组和蛋白质组学联合测序新方法,以揭示单细胞mRNA与蛋白质间的表达规律与相关关系。利用蛋白标记和测序技术,将蛋白质信号转化为DNA序列信息,从而极大地提高蛋白质的分析通量;借助基于流体力学单细胞/单微球捕获及操控芯片,突破了多组学测序中细胞利用率低的瓶颈,同时增加了细胞的分析通量;结合泵阀操控技术,移除多余核酸和抗体,获得具有极高准确性的单细胞蛋白组和转录组信息;开发单细胞转录组和蛋白质组联合分析算法,降低了非特异性吸附带来的检测影响,进一步提高了组学相关关系分析的准确性。利用该方法,本论文成功地在mRNA水平和蛋白水平上实现了乳腺癌细胞的分类分群,并首次考察了单个乳腺癌细胞中的重要基因在mRNA和蛋白表达之间的相关关系,揭示了多组学研究的重要性。同时,本论文还将该体系应用于癌症药物刺激前后单细胞多组学变化的研究,证实了蛋白表达与mRNA表达的差异性,从不同层面揭示了基因的表达规律,组学的相关性及细胞的异质性。3.开发了一种基于数字微流控技术的全自动化单细胞转录组测序平台利用数字流控技术对离散液滴的程序化操控,集成单细胞转录组文库构建,以实现全自动化的单细胞转录组文库制备,增加单细胞转录组在生物医学应用的可适性、便捷性与通用性。芯片上的亲水-疏水特征结构使得液滴在移动时快速生成单细胞液滴,克服了当前单细胞分离时面临的细胞损伤、缺乏选择性和灵活性等问题;纳升级的反应体系和芯片上的疏水界面增加了模板浓度,减少了核酸吸附,大大提高了基因检测的灵敏度;均匀的反应体积和油相隔离的反应空间减少了人为误差,隔绝了外界干扰,大大提高了单细胞转录组测量的准确性。该平台的总反应体积为540 nL,相比传统离心管方法节约了 92倍的试剂消耗,可实现低成本的转录组分析。基于该平台的自动化、高灵敏、高准确及低成本特点,本论文成功地在小鼠胚胎干细胞及小鼠胚胎成纤维细胞上实现了细胞类型区分、异质性分析和关键基因鉴别,为有效揭示单细胞基因表达规律提供新方法。4.搭建了自动化单细胞基因组和转录组联合测序平台利用数字微流控技术自动化、集成化程度高及耗样量小的特点,集成精准的单细胞捕获及裂解、核酸组分分离及扩增操控,实现高效、灵敏、准确、低成本的单细胞基因组/转录组联合测序,以揭示基因变异与基因表达间的遗传学规律。通过构筑亲水化位点,在表面张力的作用下实现快速高效的单细胞分离;利用低渗裂解及磁力作用,实现单个细胞中RNA及DNA的高效分离,降低组分间的相互干扰;构建基于疏水界面的纳升级反应体系,降低核酸吸附与试剂消耗,提高文库回收率与反应效率,实现高灵敏的多组学分析;使用均匀的液滴生成方法和油相隔离的反应空间,降低实验误差干扰,隔绝外界污染,确保高准确的单细胞多组学测量;结合有效的生物信息学算法,将基因变异信息与基因表达信息相关联,揭示遗传学发展规律。本论文成功地将该平台应用于多发性骨髓癌病人外周血及骨髓样品中单个骨髓癌细胞的研究,探究了骨髓癌基因变异对基因表达的影响机制,为骨髓癌的发生发展研究提供有力工具。