研究背景肾癌（RCC）是最常见的泌尿系肿瘤之一,约占成人恶性肿瘤的3%,死亡率也位居前列。虽然肾癌的发病率在世界范围内发达国家普遍高于发展中国家,但是我国肾癌的发病率却每年以2%递增。大多数肾癌患者早期并没有明显的典型症状,症状出现并确诊时一般较晚。尽管由于我国的卫生条件逐步完善,大多数或者在健康查体时发现了早期的无症状肾癌,但是仍然有近40%的肾癌患者出现典型症状,严重危害了我国人民的健康。肾癌们最常见的临床症状是血尿和腰痛,一部分患者会出现腹部包块。目前针对肾癌的治疗方法比较单一。对于局限性肾癌,根治性肾切除术活肾部分切除术是治疗的主要方式,但是对于转移性肾癌或者无法耐受手术的肾癌患者,没有特别良好的治疗方式,只能选择保守的综合治疗。肾癌对传统低剂量的放疗不敏感,且不良反应多,临床应用不多,而肾癌的分子靶向治疗从2000年开始处于主流,可以改善肾癌患者的预后,目前临床上使用的分子靶向药物有舒尼替尼、索拉菲尼、帕唑帕尼等,但是这些药物均会出现不同程度的耐药机制。因此,寻找新的治疗靶点来改善肾癌的药物治疗方式显得尤为重要。近年来,对于肿瘤的发生机制被认为是由于一些基因的突变导致的,即原癌基因的突变或者抑癌基因的表达被抑制。同时,由于对基因表达的研究逐渐深入,发现表观遗传控制DNA的翻译和组蛋白的修饰对于一些原癌基因和抑癌基因的表达起到了关键的调控作用。其中,G9a的作用被广泛提及。G9a属于组蛋白甲基转移酶（HMTs）的一种,是组蛋白第九位赖氨酸甲基转移酶（H3K9）。在已知的研究中,G9a通过H3K9参与了许多癌症的发生发展,其主要机制是通过染色质中组蛋白的甲基化,调节组蛋白与DNA的结合的程度,从而调低或沉默（调高或激活）一些关键基因的表达。在大多数情况下,G9a是通过抑制基因转录来调控基因的表达,这些在许多类型的肿瘤细胞的体内和体外实验中都得到验证。在结直肠癌、肝癌、胃癌、胰腺癌和卵巢癌等中,G9a通过甲基化H3K9直接抑制某些抑癌基因的启动子区域,来抑制基因的表达。例如,组蛋白甲基转移酶G9a通过抑制肿瘤基因RARRES3的表观遗传沉默促进肝癌的发展。因此G9a可能是癌症发生发展中的重要一环。但G9a在肾癌中的作用未曾被研究,故本文的目的是探究G9a在肾癌中的作用并探索其分子机制,最后评估G9a作为潜在治疗靶点的可能性。在我们的研究中,我们同通过生物信息学发现SPINK5在肾癌细胞系中的表达量与G9a的表达量成反比,我们推测SPINK5可能是G9a的下游靶点,这一点在实验中也得到了证实。丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal型5（SPINK5）位于人染色体5q32,在抗炎和抗微生物侵袭过程中起作用。而有研究表明,SPINK5在多种癌症中起到抑制肿瘤发生发展的作用,如食管癌、咽喉癌、膀胱癌、肺癌、宫颈癌等。例如,在食管癌中一种新型的肿瘤抑制因子SPINK5在食管癌的发生过程中显着减少,并且通过生物信息学分析和食管癌组织排列与食管癌的病理分化和淋巴结转移密切相关,并且SPINK5的过表达可以抑制Wnt/β-catenin信号通路抑制食管癌细胞的增殖,迁移和侵袭。在肾癌中,SPINK5同样也表现为抑癌基因,我们试图通过体内和体外实验证明G9a可以通过结合SPINK5的启动子区域,甲基化H3K9me2位点,达到抑制SPINK5的表达,从而达到促进肾癌细胞的增殖,凋亡和侵袭迁移过程,这将更加深入地探索G9a在肾癌中的作用机制。因此,本课题在前期研究基础上,进一步研究G9a如何影响肾癌细胞生物学行为,同时探索了G9a的下游靶点基因是如何调控肿瘤的发生发展的作用机制,在动物水平也验证了这一点。第一部分,运用G9a的特异性抑制剂UNC0638处理人肾癌细胞系（786-O,SN12C,OSRC-2）,检测G9a表达被抑制后对肾癌细胞系增殖和凋亡、迁移和侵袭的影响,通过CCK-8、克隆形成、流式凋亡染色、细胞划痕试验、Transwell细胞体外侵袭试验及Western blot等方法,同时构建了稳定转染的肾癌细胞系,探究G9a的表达量对肾癌细胞生物学行为的影响;第二部分,进一步探讨了G9a基因调控下游靶点基因对肾癌细胞增殖和调往,侵袭和迁移的具体机制;第三部分,通过构建裸鼠肾癌皮下移殖瘤体内实验模型,予以裸鼠腹腔注射UNC0638或者接种稳定转染后敲低G9a表达量的肾癌细胞系,探讨两者在裸鼠体内对肾癌细胞增殖与凋亡的影响。材料与方法1、我们从20例肾癌患者中获得了肾肿瘤组织和癌旁组织,通过组织切片的免疫组织化学染色以对比G9a的表达在人肾癌细胞和正常细胞中的表达情况。然后通过生物信息学数据挖掘,探索G9a在人肾癌细胞系和临床样品中的表达情况,最后选取人肾癌细胞系（786-O,SN12C,OSRC-2）和人正常肾小管上皮细胞系HK-2,提取通过蛋白质后通过蛋白质印迹对表达情况加以证实。通过生物信息学分析和从人类蛋白质图集（https://www.proteinatlas.org/ENSG00000204371-EHMT2/pathology/renal+cancer#ihc）网站获得的癌症基因组图谱（TCGA）数据,探讨了高表达G9a的水平是否与肾癌预后不良相关;2.、G9a特异性抑制剂UNC0638对多种表观遗传和非表观遗传的靶点具有选择性,用UNC0638处理各种细胞系会导致H3K9me2的水平降低。我们用UNC0638来研究G9a功能被抑制后的肾癌细胞系的生物学行为的改变。我们选用两种肾癌细胞系786-O和SN12C,根据CCK-8试验观察不同浓度和处理时间的抑制剂UNC0638处理肾癌细胞系后肾癌细胞的增殖能力,Grah Pad软件计算两种药物对肾癌细胞增殖抑制率和药物的IC50,最终确定以终浓度为0、1.5μM、3μM、6μM作用于人肾癌细胞系786-O24h,以终浓度为0、5μM、10μM、20μM作用于人肾癌细胞系SN12C,运用CCK-8、克隆形成实验、流式细胞术,划痕试验,Transwell试验等方法检测抑制剂UNC0638对肾癌细胞增殖和凋亡,迁移和侵袭的影响。用UNC0638处理两种细胞系24h后提取蛋白质,使用免疫蛋白印迹方法检测细胞内的Bax,Bcl-2,H3K9me2,E-cadherin,N-cadherin,Vimentin等蛋白质表达变化情况。3、构建敲低G9a的稳定细胞系,在敲低G9a后,运用CCK-8、克隆形成实验、流式细胞术,划痕试验,Transwell试验等方法检测肾癌细胞系786-O的细胞生物学行为的改变,同时使用免疫蛋白印迹方法检测细胞内的Bax,Bcl-2,H3K9me2,E-cadherin,N-cadherin,Vimentin等蛋白质表达变化情况。4、为了进一步研究G9a如何调控肾癌细胞的生物学行为,我们假设G9a可以在表观遗传上沉默下游基因的表达以实现癌变。通过文献综述,我们测定了可能是G9a下游靶点的五个基因。我们发现在敲低G9a的肾癌细胞系中只有SPINK5和p53的表达量被上调。通过生物信息学的发掘,我们在ONCOMINE数据库中发现SPINK5的表达与G9a的表达呈负相关。G9a在6个肾癌细胞系中上调。相反,在这些细胞系中SPINK5被下调。相关分析表明,在这些肾癌细胞系中,G9a的表达与SPINK5的表达呈负相关。我们在稳定敲低G9a的细胞系中再次敲低SPINK5,运用CCK-8、划痕试验,Transwell试验等方法检测肾癌细胞系786-O的细胞生物学行为的改变,同时使用免疫蛋白印迹方法检测细胞内的E-cadherin,N-cadherin,Vimentin等蛋白质表达变化情况。最后使用Ch IP试验证明G9a与SPINK5之间的关系。5、选取人肾癌786-O细胞系和稳定敲低G9a的细胞系,PBS重悬细胞调整细胞浓度4×107/m L,接种至裸鼠后背部皮下（每只裸鼠接种体积100μL）,构建裸鼠肾癌皮下移植瘤模型后,将裸鼠随机分组,其中两组种植786-O后注射生理盐水、UNC0638,两组种植敲低G9a肾癌细胞系的阴性对照和试验组,观察裸鼠状态和瘤体的生长情况并做好记录,断颈椎处死裸鼠,分离剥除皮下移植瘤,称瘤体重量,去肿瘤组织进行免疫化学染色,并绘制瘤体生长曲线、免疫蛋白印迹方法检测Bax,Bcl-2,H3K9me2,E-cadherin,N-cadherin,Vimentin的表达情况。结果1、我们从20例RCC患者中获得了肿瘤组织和邻近组织发现肾癌组织中的G9a表达量明显高于癌旁组织,我们提取了四对肾癌组织和癌旁组织的蛋白质,实验结果与免疫组化的结果保持一致。然后,通过生物信息学数据挖掘,从人类蛋白质图集（Human protein atlas）发现G9a在人肾癌细胞系和临床样品中高表达,并且其高表达和肾癌的不良预后相关（p＜0.05）。我们进一步通过蛋白印迹实验测量了细胞系中G9a的表达水平。我们使用了人肾小管上皮细胞系hexokinase-2（HK-2）和3种肾癌细胞系（即786-O,SN12C和OSRC-2）。蛋白质印迹分析的结果表明,RCC细胞系中的表达水平高于HK-2细胞中的表达水平。我们的结果表明,G9a在肾癌中普遍高表达,其高表达与RCC的预后不良有关。2、通过CCK-8分析,我们证明UNC0638显着抑制了786-O和SN12C细胞的生长（图2A）。我们根据CCK-8分析的结果设置两种细胞系的药物浓度,最终确定以终浓度为0、1.5μM、3μM、6μM作用于人肾癌细胞系786-O24h,以终浓度为0、5μM、10μM、20μM作用于人肾癌细胞系SN12C,该实验证明随着特异性G9a抑制剂UNC0638的浓度上升,肾癌细胞的增殖能力逐渐减弱。我们使用Annexin-V-FITC/PI双重染色法通过流式细胞仪检测细胞凋亡。凋亡的786-O和SN12C细胞的数量随着药物浓度的增加而逐渐增加。同样,集落形成实验表明,随着药物浓度的增加,786-O和SN12C细胞的增殖受到显着抑制,形成的集落明显减少。根据蛋白质印迹分析的结果,UNC0638可显着抑制786-O和SN12C细胞中的H3K9me2。凋亡基因Bax的表达与药物浓度的增加同时增加,而凋亡保护基因B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）的表达则降低。这表明G9a可能通过抑制RCC细胞凋亡来促进肿瘤生长。我们进行了划痕试验和transwell实验以探索G9a对肾癌细胞迁移和侵袭的影响。我们发现,加入抑制剂后,786-O细胞的迁移和侵袭能力受到明显抑制。在SN12C细胞中也注意到了相同的结果。我们的结果充分证明,在抑制G9a后,肿瘤的迁移和侵袭能力显着降低。我们的蛋白质印迹实验表明,用抑制剂处理后,E-钙黏着蛋白的表达显着增加,而N-钙黏着蛋白和波形蛋白的表达则明显降低。这些发现表明,在阻断G9a的功能后,肿瘤的上皮间质转化过程被显着抑制。因此,G9a可能与肾癌的侵袭和转移密切相关。3、我们使用在786-O中构建了稳定的G9a敲低肾癌细胞系,以进一步探索G9a的作用。成功敲低G9a后,我们通过CCK-8试验观察到了敲低G9a后对细胞增殖有显着抑制,并且用Annexin-V-FITC/PI双重染色法通过流式细胞仪检测到凋亡的786-O细胞数量较对照组显著增加。此外,我们的克隆形成实验表明,敲低G9a后786-O细胞形成的克隆数量较对照组明显减少,而阴性对照组较空白对照组没有显示出明显的变化。同样,我们使用划痕试验和Transwell小室侵袭实验研究G9a表达降低对肾癌的迁移侵袭能力的影响。我们的结果表明,G9a的低表达导致肾癌细胞迁移和侵袭的显着减少,这与之前使用特异性抑制剂实验中观察到的结果一致。最后,蛋白质印迹证实了这些结果。H3K9me2的表达明显下降,凋亡促进基因Bax上调,凋亡抑制基因Bcl-2下调,上皮-间质转化（EMT）促进基因下调,EMT抑制基因上调。根据这些结果,G9a的损失导致肾癌的致癌性降低。我们假设,G9a的缺失导致下游靶点H3K9me2的甲基化减少,从而激活某些基因的表达并最终导致致癌性降低。4、我们假设G9a可以在表观遗传上沉默下游基因的表达以实现它的致癌性。因此,我们试图探索G9a下游的致癌机制。通过文献综述分析,我们鉴定了可能是G9a下游靶点的五个基因（SPINK5,ANKRD1,PTGS1,P53,RARRES3）。我们发现对比正常的肾癌细胞系786-O,敲低G9a表达量后五个基因中只有SPINK5和p53上调。为了进一步分析这两个基因是否是G9a的下游靶点,我们用生物信息学分析检测到G9a和SPINK5之间存在相关性。通过ONCOMINE数据挖掘,显示G9a在6个细胞系中上调（ACHN,786-O,RXF393,UO-31,TK-10,SN12C）。相反,在这些细胞系中SPINK5被下调。相关分析表明,在这些肾癌细胞系中,G9a的表达与SPINK5的表达呈负相关。因此,我们假设SPINK5是G9a的下游目标基因之一。使用si RNA,我们在稳定的敲低G9a的786-O细胞系中敲低了SPINK5的表达。通过划痕试验和Transwell小室侵袭实验,我们看到尽管G9a的低表达导致了肾癌细胞系的迁移和侵袭能力下降,但是紧接着敲低SPINK5之后肾癌细胞的迁移和侵袭能力得到了恢复。蛋白质印迹实验同样表明,敲低SPINK5的G9a地表达的786-O细胞的增殖,迁移和侵袭能力得到了增强。最后,为了探究G9a与SPINK5之间的关系,我们设计了Ch IP试验,G9a可以结合到SPINK5的启动子区域。用Ch IP分析了G9a蛋白（H3K9me2蛋白）与下游靶标SPINK5启动子序列的相互作用。设计并合成了与SPINK5启动子序列匹配的特异性引物。分析显示,在通过sh RNA沉默G9a之后,SPINK5启动子区域的G9a结合水平和H3K9me2水平降低。我们的补救实验和Ch IP实验证实了我们的假设,即G9a可以增强肾癌的致癌性,这是通过在启动子区域的H3K9me2位点甲基化使肿瘤抑制基因SPINK5表观遗传沉默来实现的。有趣的是,在抑制G9a之后,SPINK5和p53的表达水平被上调。在补救实验中,我们在同时敲低G9a和SPINK5后发现p53的表达下调。这表明p53可能是SPINK5的下游靶标。5、在敲低G9a表达量或者使用抑制剂抑制G9a后,异种移植肿瘤明显小于对照组。在我们的免疫组织化学实验中,体外异种移植物的EMT指标存在显着差异。免疫组织化学染色表明,G9a的EMT指标在体外显示出显着变化。在G9a调低或被抑制时,N-钙粘蛋白的表达减少,而E-钙粘蛋白的表达增加。我们的蛋白质印迹分析证实了这一发现。我们的体外异种移植实验表明,G9a可以在体内影响肾癌细胞的增殖和EMT过程。这与体外细胞实验中的观察结果一致。结论G9a在肾癌中表达量普遍上调,而G9a可以在体外和体内促进肾癌的发展,抑制G9a或者调低其表达量均可以降低肾癌细胞的增殖,迁移和侵袭能力。此外,我们确定SPINK5为G9a的下游目标基因之一。因此,靶向G9a可能是治疗肾癌的新方法。