【摘 要】
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目的:探讨溴结构域蛋白4(bromodomain-containing protein 4,BRD4)在椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)进程中髓核(nucleus pulposus,NP)细胞内的表达情况及其可能参与机制。方法:前瞻性收集2019年06月～2019年12月因腰椎间盘突出症、腰椎滑脱及脊柱侧弯就诊于兰州大学第二医院骨科行手术治疗患
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目的:探讨溴结构域蛋白4(bromodomain-containingprotein4,BRD4)在椎间盘退变(intervertebraldiscdegeneration,IDD)进程中髓核(nucleuspulposus,NP)细胞内的表达情况及其可能参与机制。方法:前瞻性收集2019年06月～2019年12月因腰椎间盘突出症、腰椎滑脱及脊柱侧弯就诊于兰州大学第二医院骨科行手术治疗患者的NP组织标本39例。根据Pfirrmann分级标准(分为I～V级)评估IDD程度。HE染色观察不同退变程度NP组织的镜下形态,免疫组化、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹试验(Westernblot)检测不同退变程度NP组织中BRD4表达水平。随后,我们对人源原代NP细胞进行分离、培养及鉴定,构建IL-1β诱导的NP细胞衰老模型,针对BRD4构建慢病毒介导的小干扰RNA(si-BRD4)转染NP细胞使BRD4表达抑制,并使用3-甲基腺嘌呤(3-MA)阻断自噬过程。综合运用Westenblot、免疫荧光、透射电镜、衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-Gal)染色、Hochest33258染色和TUNEL染色等技术检测NP细胞衰老、凋亡、自噬和细胞外基质(extracellularmatrix,ECM)蛋白相关指标及自噬相关通路(AMPK/mTOR/ULK1通路)蛋白表达情况。最后,我们建立细针穿刺诱导大鼠IDD模型,运用MRI和免疫组化技术评估体内BRD4下调后对IDD的治疗作用。结果:NP组织临床标本研究结果表明:根据Pfirrmann分级标准,不同退变程度NP组织镜下HE染色形态不同,在I～II级退变中,NP组织中的胶原纤维排列较为整齐,ECM深染,可出现少量较小的空泡细胞且分布均匀;在III级退变中,NP组织胶原纤维排列不整,胶原纤维增粗,可见聚集较多的团块状结构;在IV～V级退变中,NP细胞大量聚集,呈现为较大的空泡细胞,胶原纤维排列紊乱且出现明显缺失。免疫组化结果显示,BRD4表达水平随着Pfirrmann等级而增加。qRT-PCR结果显示,随着Pfirrmann等级增加,BRD4mRNA表达水平增加,且BRD4mRNA水平增加与Pfirrmann等级呈正相关关系。Westenblot结果同时证明了严重退变的NP组织中BRD4蛋白表达量显著增加。细胞功能实验研究结果表明:si-BRD4转染细胞后可显著降低IL-1β诱导的NP细胞衰老和凋亡水平;BRD4下调可通过调控AMPK/mTOR/ULK1通路激活NP细胞自噬;而使用自噬抑制剂3-MA抑制NP细胞自噬过程后显著减弱了BRD4的这种抗衰老和抗凋亡作用。此外,BRD4下调还可通过激活自噬使NP细胞ECM合成代谢增强而分解代谢减弱。最后,在大鼠IDD模型中,通过将si-BRD4在大鼠尾椎IVD局部注射使NP内BRD4表达抑制后可显著降低NP细胞衰老和凋亡相关蛋白的水平,并改善大鼠IDD相关的ECM代谢紊乱。结论:随着IVD退变程度的加重,BRD4表达水平显著上调,并参与IDD发生发展,其机制可能是通过调控AMPK/mTOR/ULK1通路介导自噬进而调节人源NP细胞衰老和凋亡来实现的。
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