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阿魏酸酯酶是一种能水解植物细胞壁的关键酶,并释放阿魏酸。另外,阿魏酸酯酶能从许多微生物中被分离出来,但阿魏酸酯酶的活性和表达水平低,制约了该酶的应用。为提高阿魏酸酯酶A的活性或表达水平,本研究构建阿魏酸酯酶A双拷贝基因工程菌,并初步探究阿魏酸酯酶A的免疫原性。主要研究内容及其结果如下:1.阿魏酸酯酶A双拷贝基因工程菌的构建及其酶学性质的研究采用PCR技术从黑曲霉GIM3.452扩增出阿魏酸酯酶A基因的cDNA序列,全长为846 bp,总编码282个氨基酸。并经NCBI Blast序列比对发现,该基因序列与GenBank已报道黑曲霉阿魏酸酯酶A基因序列的同源性高达90%以上。该序列在GenBank上的登录号是KP126605。将不含信号肽的AnFaeA基因分别与毕赤酵母表达载体pPIC9K和pPICZαA连接,获得重组表达质粒pPIC9K-AnFaeA和pPICZαA-AnFaeA。先将pPIC9K-AnFaeA重组表达质粒经Pme I线性化后电转化毕赤酵母GS115宿主菌。通过摇瓶诱导表达筛选,获得一株酶活性最高为2.4 U/mL的工程菌,命名为GSKFA3。再将Sac I线性化后的pPICZαA-AnFaeA重组表达质粒电转化GSKFA3感受态细胞,并将其置于含Zeocin抗性的YPDS平板上培养。经筛选得到一株高效表达的双拷贝基因工程菌(酶活性为10.6 U/mL),命名为GSKZαFA20。经PCR检测发现,该基因能整合至毕赤酵母基因组上,并有良好的遗传稳定性。SDS-PAGE电泳和Westem-blot检测发现,所获得的表达产物是分子量为40 kDa的阿魏酸酯酶A糖基化蛋白。通过优化重组蛋白的培养条件,结果发现经1%甲醇诱导培养7d后,其酶活性高达15.49U/mL。酶学性质结果表明,重组阿魏酸酯酶A的最适温度是50℃,最适pH为6.0,且温度低于45℃和pH值为4.0～6.0时均具有较好的稳定性。2.阿魏酸酯酶A对小鼠免疫原性的研究选用63只3周龄体重相近、健康的雄性昆明小鼠,随机分为3组,每组21只小鼠。试验组小鼠在第5、15、25 d时背部皮下注射0.1 mg阿魏酸酯酶A蛋白,空载组小鼠注射相同剂量pPICZαA转X-33酵母宿主菌的诱导表达上清。记录小鼠的采食量和体重变化,采用ELISA技术检测小鼠血清中IFN-γ、IL-4和IgG的含量。结果发现,体内注射阿魏酸酯酶A对小鼠的生长无显著影响(P>0.05)。但阿魏酸酯酶A可显著提高小鼠血清中IFN-γ、IL-4和IgG的含量(P<0.05),且对照组和空载组之间差异不显著(P>0.05)。Western-blot检测结果表明阿魏酸酯酶A具备良好的反应原性。以上研究结果表明,阿魏酸酯酶A具有良好的免疫原性和反应原性,能启动机体细胞免疫和体液免疫,影响小鼠机体的免疫水平。综上所述,本研究通过构建阿魏酸酯酶A的双拷贝基因工程菌,并经过优化培养条件获得了高效表达阿魏酸酯酶A的双拷贝基因工程菌;黑曲霉GIM3.452阿魏酸酯酶A具有良好的免疫原性和反应原性,能启动机体细胞免疫和体液免疫,影响机体的免疫水平。这将为今后开发高效表达的阿魏酸酯酶A提供有价值的参考资料,同时为后续深入研究阿魏酸酯酶A的功能提供一定的理论依据。