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单链抗体是利用基因工程方法使抗体重链可变区(V_H)和轻链可变区(V_L)通过一段约5-25个aa的连接肽,首尾拼接而成的重组蛋白。本实验所研究的抗肺癌单链抗体(LC-1 single-chain FV,LC-1 ScFv)是由抗肺癌杂交瘤细胞株(LC-1)分泌的单克隆抗体经过基因改造得到的,是具有与抗原结合能力的最小抗体片段。目前,由于单链抗体的优越性,它在许多肿瘤疾病的临床诊断及免疫治疗中已经取得广泛的应用,如体内显像、放射免疫治疗、免疫毒素治疗等。本实验的目的是利用基因工程技术获得有活性的抗肺癌单链抗体。 本实验从高分泌量和活力较高的抗肺癌杂交瘤单克隆细胞株中抽提总RNA,反转录成cDNA。设计引物从cDNA中PCR克隆出抗体的重链和轻链基因,克隆到T载体保存并测序,并且通过酶切鉴定。将重链和轻链基因经重叠延伸PCR法构建为单链抗体形式,回收并与T载体连接,转化大肠杆菌。以上游引物Vsbak和下游引物Vsfor为引物,以T-ScFv’为模板PCR,对单链抗体基因进行改造得到ScFv。回收PCR产物,酶切后连接于pET-22b(+)质粒构建成pET22-ScFv质粒。转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导后,重组蛋白得到高效表达而形成包涵体。抽提包涵体蛋白,得到较纯的目的蛋白,通过蛋白复性技术使之复性,本文对复性条件进行了摸索。用Ni-NTA树脂纯化出目的蛋白,SDS-PAGE电泳分析其纯度,并初步分析目的蛋白活性。竞争ELISA实验表明产物具有与天然抗体相近的活力。 本实验成功地构建了pET22-ScFv基因,然后利用大肠杆菌表达系统以包涵体的形式表达了pET22-ScFv蛋白,表达产物为分子量31kD左右的蛋白分子,与预期一致。大量表达目的蛋白,并对表达的蛋白质进行了纯化和复性,获得了具有与天热抗体相近活力的LC-1 ScFv。 本实验获得了能够与LC-1肺腺癌单抗相关抗原反应的ScFv,从而为其靶向诊断、治疗及进一步基因工程改造奠定了基础。此外,我们还可以应用基因工程技术得到ScFv融合蛋白,它和ScFv一样能在各个表达系统中得到有效的表达,可以大规模生产抗体融合蛋白,具有很大的应用潜力。