论文部分内容阅读
黑胸大蠊浓核病毒(Periplanta fuliginosa densovirus,PfDNV)基因组负链编码衣壳蛋白(viral capsid protein,VP)。病毒感染黑胸大蠊后其VP mRNAs经由可变剪接产生。SDS-PAGE分析显示病毒衣壳中含有五个衣壳蛋白,105kDa (VP5)、82kDa (VP4)、79kDa (VP3)、56kDa (VP2)、52kDa (VP1)。而对其VP mRNAs的序列分析显示它们可编码产生大小为52kDa (VP52)、65kDa (VP65)、85kDa (VP85)的三个候选衣壳蛋白。因此推测产生衣壳蛋白的数目与SDS-PAGE结果不一致。为了确定由mRNAs序列分析得出的VP52、VP65、VP85与SDS-PAGE显示的VP1-5间的关系,我们用含病毒基因组的重组质粒PUC119-PfDNV转染黑胸大蠊幼虫获得VPmRNAs后将所得VP52、VP65、VP85蛋白的开放阅读框(ORF)克隆入真核表达载体,利用杆状病毒表达系统,表达相应蛋白。在获得VP mRNAs的过程中,在已知的剪接供体位点sd1、sd2、sd3和剪接受体位点sa1、sa2、sa3的基础上,我们发现了额外的剪接供体位点sd4、sd5和剪接受体位点sa4;并在已知的五种PfDNV VP mRNAs (sd1sa1&sd2sa2,sd1sa1&sd2sa3,sd1sa1&sd3sa3,sd3sa3及未剪接VP mRNA)的基础上另外发现了三种VP mRNAs (sd4sa1&sd2sa2, sd4sa1&sd3sa3, sd1sa1&sd5sa4)。非常有趣的是,这三个新VP mRNAs无编码新的候选衣壳蛋白的能力,即所有VP mRNAs仍只编码产生VP52、VP65、VP85。通过表达的VP52、VP65、VP85蛋白与病毒粒子衣壳蛋白的western blot匕较,我们发现VP52即VP2,VP65即VP3&4,VP85即VP5,我们认为VP1是VP2(VP52)在病毒成熟后的N端水解产物。进一步研究发现在6%SDS-PAGE电泳后western blot检测时,VP3&4(VP65)显示出四条带:在VP65N端加入Flag标签、C端加入His标签后检测时仍为四条带,表明它们并非由VP65表达过程中N端降解或C端提前终止产生;因此VP65存在翻译后修饰。对病毒粒子的酪氨酸磷酸化检测结果表明,PfDNVVP蛋白存在酪氨酸磷酸化修饰;其中VPl的酪氨酸磷酸化最强,VP2(VP52)、VP3&4(VP65)的酪氨酸磷酸化较弱,VP5未检测到磷酸化信号;然而在用去酪氨酸磷酸化酶(PTP)及去丝氨酸、苏氨酸磷酸化酶(Lambda PP)处理时,真核表达的VP65的带型并未改变,因此酪氨酸磷酸化并不是导致四条带产生的原因。此外,对病毒粒子的泛素化检测无信号,结合上述实验结果我们推测还有其他类型的翻译后修饰形式存在。由于VP52的序列完全位于VP65内并且相同表达条件时VP52只有一条带,因此我们认为导致VP65产生四条带的修饰位置在其独有的N端113个氨基酸上。浓核病毒在宿主细胞核内复制、包装,故在细胞质中合成的衣壳蛋白需进入细胞核发挥作用。PfDNV的衣壳蛋白应该也具有相似的情况。由于直接利用PfDNV病毒粒子进行各衣壳蛋白功能研究的可操作性较低,而我们在真核细胞中成功表达了VP52、VP65、VP85蛋白,并确定它们为PfDNV衣壳蛋白。因此我们进一步研究了VP52、VP65、VP85蛋白在Sf9细胞中的分布及包装情况。通过间接免疫荧光及分离细胞核、质组分进行western blot的方法,我们发现VP52、VP652VP85单独在Sf9中表达时均可进入细胞核;此外在VP65N端加入Flag标签或C端加入His标签或N端加入Flag标签的同时C端加入His标签时,都不影响VP65的核定位。通过PSORT Ⅱ软件分析发现VP52、VP65、VP85含有可能的共同核定位序列PPNKKAKT。为确定该序列是否有决定VP入核的功能,我们研究了一系列N端缺失的VP65蛋白的分布情况。实验结果表明缺失VP65N端242个氨基酸时不影响其在细胞内的分布。因预测的核定位序列PNKKAKT位于VP65的143-150位,因此表明该序列不具备核定位功能。此外我们还研究了缺失C端100个氨基酸的VP65的分布情况,实验结果表明缺失C端100个氨基酸时亦不影响VP65的分布。由此我们推测PfDNV VP上不存在典型的核定位信号,VP入核可能依靠其自身空间结构上的信息或细胞因子的辅助作用。我们在确定PfDNV VP可以入核后进一步研究了这些入核的VP是否能够包装并最终形成病毒粒子。实验结果表明,VP52、VP65、VP85单独存在时都可以形成蛋白聚集体,而VP52、VP65单独表达时皆可形成病毒类似粒子,VP85则不能,由此我们认为VP85不是病毒包装所必需的。VP52、VP65、VP85混合表达时也可形成病毒类似粒子,并且所形成的病毒类似粒子似乎更接近于野生型病毒粒子。综上所述,VP52、VP65、VP85是PfDNV的衣壳蛋白,VP52即VP2,VP65即VP3&4,VP85即VP5;VP65存在翻译后修饰,VP3&4是VP65的不同翻译后修饰形式;VP1可能是VP2(VP52)的N端水解产物;VP52、VP65、VP85单独表达时均可进入细胞核;PfDNV VP上无典型的核定位信号,VP可能依靠其自身空间结构上的信息或细胞因子的辅助作用入核;VP52、VP65单独表达时皆可形成病毒类似粒子,VP85则不能,由此我们认为VP85不是病毒包装所必需的。武汉野田村病毒(Wuhan nodavirus,WhNV)含两条正链RNA,其中RNA1编码RNA依赖的RNA聚合酶,RNA2编码衣壳蛋白。病毒复制过程中产生亚基因组RNA3,编码大小约为9kDa的蛋白B2。B2蛋白是一个可使病毒逃脱宿主抗病毒机制的RNAi抑制蛋白。B2蛋白可以结合dsRNA,通过阻止Dicer蛋白对dsRNA的切割及阻止siRNA产生的方式达到抑制RNAi的作用;同时B2蛋白也能直接与siRNA发生相互作用,阻止其形成沉默复合体(RISC),从而达到RNAi抑制作用。B2蛋白是以同源二聚体的形式发挥作用的。Dicer蛋白是RNAi通路中一个非常重要的、具有RNaseH活性的蛋白。弗洛克豪斯病毒B2蛋白在体外能够与Dicer-2蛋白的PAZ结构域结合,从而暗示了野田村病毒B2蛋白可能能够与Dicer蛋白发生相互作用。武汉野田村病毒B2蛋白也可在果蝇细胞S2中抑制RNAi。在本研究中我们通过免疫共沉淀、GST pull-down的方法对武汉野田村病毒B2蛋白与果蝇细胞S2中的Dicer蛋白间的相互关系进行了研究。实验结果表明,武汉野田村病毒B2蛋白可结合果蝇细胞S2中的Dicer-2蛋白,不能结合Dicer-1蛋白,从而再次证明武汉野田村病毒B2蛋白抑制的是由siRNA介导的RNAi途径;此外dsRNA的加入极大地促进了B2蛋白与Dicer-2蛋白的相互作用。进一步的研究表明,与Dicer-2蛋白发生相互作用的是B2蛋白的C端二十一个氨基酸,缺失这些氨基酸时B2蛋白不能与Dicer-2蛋白结合;然而缺失其N端二十个氨基酸时,B2蛋白亦不能与Dicer-2蛋白结合,我们认为这是由于N端缺失的B2蛋白不能形成同源二聚体导致的B2蛋白与Dicer-2蛋白间相互作用的丧失,因此B2蛋白是以二聚体的形式发挥其与Dicer-2蛋白间的相互作用的。最后我们发现Dicer-2蛋白的PAZ结构域、RNase结构域均可与武汉野田村病毒B2蛋白发生相互作用而结合。综上所述,除了通过直接结合dsRNA及siRNA,阻止RNAi发生的方式外;武汉野田村病毒B2蛋白也可通过其C端二十一个氨基酸与果蝇细胞S2中的Dicer-2蛋白上的PAZ结构域及RNase结构域结合,从而发挥RNAi抑制作用。因此武汉野田村病毒B2蛋白是一个多功能、多途径抑制RNAi过程的蛋白。