论文部分内容阅读
Lux发光基因可编码合成荧光素酶,进而催化底物进行发光反应,产生波长约为450-490nm的可见蓝绿光,其作为报告基因被迅速地应用于在线观测、环境监测、食品安全控制、活体动物检测等多种研究领域。细菌生物膜是细菌对恶劣环境产生的应激反应而形成的一种自我保护状态,细菌形成生物膜后难以被除杀灭,给食品加工、医疗卫生等领域带来危害和难题。本研究将质粒pHSG396-P.luxCDABE(携带发光光杆状菌lux基因片段)导入大肠杆菌DH5α,以检测发光情况和酶切电泳验证等手段,筛选出成功表达发光的重组大肠杆菌,成功构建形成生物膜能力良好的重组发光大肠杆菌模型。对重组发光大肠杆菌的生理特性及生物膜与发光强度的关系进行了深入研究,试验得出以下结论:1.重组发光大肠杆菌的生理特性:(1)以新鲜LB液体培养基培养重组发光大肠杆菌,测定其生长曲线和发光曲线。结果显示,重组发光大肠杆菌在培养的0-3 h为调整期,4-8 h为对数期,第9 h进入稳定期;在调整期和对数期初期发光微弱,进入对数期后,发光强度快速增长,在第9 h达到培养阶段的最大发光值2510 RLU,进入稳定期后,发光强度逐渐减弱。(2)不同的培养环境(IPTG浓度、pH、Cml浓度、癸醛浓度、温度)下,测定重组发光大肠杆菌的生长OD600nm值和发光强度。结果显示,IPTG加入量小于0.2 mg/mL时,对发光强度的促进作用微弱,超过这个量则对发光强度起到了抑制作用;其在pH 5-9范围内能够发光,pH 7时生长和发光强度最大,pH 8弱碱性环境中发光强度高于pH 6弱酸性环境(生长浓度相同);Cml添加量为0-37.5μg/mL时,对其生长和发光强度影响微弱,超过此范围,则对生长有一定抑制作用;癸醛的添加对发光强度无促进作用;在37℃下,其生长和发光强度达到最大值,最高耐受温度为43℃;室温下,前15 min发光强度呈下降趋势,之后趋于平缓,在2 h内,发光强度始终处于400 RLU以上。2.重组发光大肠杆菌生物膜与发光强度的关系:(1)在四种因素(pH、D-甘露糖、菌悬液浓度、Cml浓度)条件下培养重组发光大肠杆菌生物膜,以结晶紫染色法和测定发光强度法对生物膜的生成量进行测定。结果显示,pH 8的弱碱性条件比pH 7的中性条件更利于生物膜的生长;D-甘露糖为培养重组发光大肠杆菌生物膜所必需,添加量为2.0%时,生物膜形成量最大;菌悬液OD600nm值为0.3时,为最佳配比,最利于生物膜的形成,过高或过低均不利于生物膜的生长;Cml浓度为12.5μg/mL时,为本次试验培养重组发光大肠杆菌生物膜的最适浓度。(2)将发光强度法得到的数据与结晶紫染色法数据进行回归分析。结果显示,两种方法得到的数据线性相关性良好(R-Sq>90%),说明在适宜的培养条件下,发光强度法同样可以衡量细菌生物膜的生成量。