炎症性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一组原因未明反复发作的慢性炎症性肠道疾病。临床表现为慢性腹泻、腹痛,甚至便血。IBD不仅严重影响患者生活质量,值得关注的是,长期的慢性炎症极易诱发结直肠肿瘤(Colitis-Associated Cancer,CAC)。在结肠炎性反应中IL-1、IL-6和TNF-α等促炎细胞因子的刺激下,进一步加剧了结肠上皮癌变的演变过程。IBD的发病机制异常复杂,涉及遗传、免疫等多个环节。阐明IBD的调控机制,有助于为其治疗提供重要的药物作用靶点,并为进一步预防结肠炎相关性肿瘤具有重要意义。NDRG2(N-Myc down-stream regulated gene 2)是本课题组脑组织首次发现并报道的一个新抑癌基因,通过抑制肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤的恶性转移、促进肿瘤细胞凋亡、增加肿瘤细胞的化疗药物敏感性、促进DNA的损伤修复等诸多生理过程,发挥着其抑癌基因的功能。课题组对NDRG2在结直肠癌发生发展过程中的作用进行了系统研究,发现NDRG2可以抑制结直肠癌细胞的增殖、侵袭和转移能力,并首次证实NDRG2是一个新的结直肠癌预后生物标记物。但是,NDRG2是否参与IBD的发生发展过程不得而知。。为了深入认识NDRG2的作用机制,我们基于Cre/LoxP系统建立了肠道上皮细胞特异性的Ndrg2条件性基因敲除小鼠(Vil-Cre;Ndrg2flox/flox)。并利用葡聚糖硫酸钠(DSS)和AOM/DSS诱导模型,分别建立了小鼠肠道炎症模型和炎癌转化模型,并进一步结合临床组织标本,分析NDRG2的临床意义,旨在明确NDRG2在IBD发生发展过程中的生物学功能,并揭示NDRG2在在结肠炎导致的结肠癌这一恶性转化过程中的抑癌基因功能。我们这一研究将进一步拓展NDRG2的功能和研究视野。【目的】1.明确NDRG2是否参与了结肠炎的病理反应过程。2.揭示NDRG2在结肠炎的病理过程中的分子机制。3.阐明NDRG2在结肠炎相关性结直肠癌恶性转化过程中的功能。【方法和结果】1.NDRG2在DSS和LPS诱导的结肠炎病理过程中表达下调我们利用DSS建立了小鼠的肠道炎症诱导模型。通过小鼠表型分析和组织学评价,发现DSS可以诱导明确的结肠炎性反应,并且在这个反应过程中,雄性小鼠相较于雌性小鼠表现出了更加明显的炎性表型。因此,在我们的后续实验中,全部采用雄性小鼠进行后续的实验。随后我们分析了NDRG2在DSS所诱导的结肠炎小鼠结肠上皮细胞中的表达变化规律,发现NDRG2的表达在此过程中明显下降。同时,通过结肠注射脂多糖(LPS),也同样发现NDRG2在小鼠结肠上皮细胞中的表达下调。此结果提示NDRG2在结肠炎性反应过程中发挥重要作用,为后续的功能研究奠定基础。2.NDRG2缺失增加DSS所诱导的结肠炎的敏感性我们利用本课题组所构建的肠上皮细胞中特异性敲除Ndrg2的转基因小鼠((Vil-Cre;Ndrg2flox/flox,ΔIEC),通过给予DSS处理,诱导结肠炎模型。发现NDRG2的缺失导致小鼠小鼠的体重下降加剧、结肠长度缩短、结肠上皮损伤加剧等病理过程。并在致死剂量DSS的作用下,ΔIEC小鼠表现出更高的敏感性。在DSS所诱导的结肠炎过程中,NDRG2缺失可促进趋化因子CXCL-1、CXCL-2和CCL-5的表达,促使单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞向炎性病灶的募集显著增加。同时,NDRG2缺失还进一步上调促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达,而抑制抗炎细胞因子IL-10的表达,从而加剧结肠炎的病理过程,这一过程也在LPS诱导的结肠炎反应中得到了验证。进一步,我们在溃疡性结肠炎的患者组织中,也发现NDRG2的表达丰度与CD68+巨噬细胞在炎性病灶的募集呈显著的负相关。我们发现在DSS所诱导的结肠炎反应过程中,NDRG2的缺失并不影响磷酸化STAT3的活性,而NF-κB的磷酸化水平明显上调,从而加剧结肠炎的病理过程。在本课题中,我们首次利用Ndrg2敲除小鼠证实NDRG2的缺失可增加DSS所诱导的结肠炎敏感性。3.NDRG2缺失导致结肠上皮细胞间的粘附连接结构异常结肠上皮组织通透性增加是结肠炎性反应易感性增强的重要诱因。为了进一步明确NDRG2在结肠炎的反应过程的作用机制,我们通过灌胃给予FITC-Dextran处理和小鼠肠道注射LPS,评价NDRG2缺失对小鼠结肠上皮通透性的影响。结果显示,NDRG2的缺失导致小鼠结肠上皮组织通透性显著增加,而且在DSS诱导结肠炎后,NDRG2缺失导致的通透性增加程度更加显著。为了进一步明确NDRG2缺失对结肠上皮通透性增加的机制,我们利用扫描电镜检测了NDRG2缺失小鼠(ΔIEC)结肠上皮细胞的显微结构。发现NDRG2的缺失导致结肠上皮细胞间的粘附连接结构出现明显的异常,导致粘附连接结构不完整。既往研究显示,E-cadherin是粘附连接的关键分子。因此,我们分析了E-cadherin在WT和ΔIEC小鼠的结肠上皮细胞中的表达差异。发现NDRG2的缺失导致E-cadherin的mRNA和蛋白丰度都受到明显的抑制,而E-cadherin的表达下调则是由于Snail和Slug的表达上调所致。我们在人结肠癌细胞HT-29和Caco-2中通过干涉NDRG2的表达,进一步证实了该结论。在人的正常结肠上皮组织中,NDRG2的表达丰度与E-cadherin的表达也呈显著的正相关。这充分说明NDRG2在结肠上皮细胞中通过调控E-cadherin的表达和粘附连接结构的完整性,从而参与结肠炎的发生和发展病理过程。4.NDRG2缺失促进AOM-DSS所诱导的结肠炎/癌恶性转化过程AOM-DSS模型是诱导结肠炎相关性结肠癌的成熟方法。AOM可诱导β-catenin突变,导致β-catenin的过度活化,DSS诱导的结肠炎性反应则进一步加剧炎/癌的恶性转化过程,最终导致结肠炎的癌变。我们分别给予WT和ΔIEC小鼠进行AOM-DSS处理,分析NDRG2缺失对结肠炎诱导的结肠癌演变过程的影响。结果发现NDRG2缺失导致结肠肿瘤的数量和体积都有着显著的增加,并且肿瘤瘤体的恶性程度要远高于WT组,证实NDRG2缺失促进了结肠炎/癌的恶性转化过程。【结论】利用肠上皮细胞中特异性敲除Ndrg2的转基因小鼠,我们首次发现并证实了NDRG2对结肠炎发生发展过程的调控作用。发现NDRG2缺失可通过上调Snail和Slug的表达,抑制E-cadherin的丰度,从而破坏结肠上皮细胞间的粘附连接结构,导致肠道上皮细胞的通透性增加,加剧结肠炎的发病易感性。同时,我们也首次证明了NDRG2缺失可促进结肠炎/癌的恶性转化过程。我们的研究为NDRG2的抑癌基因角色提供了坚实的证据,并为基于NDRG2在炎症性肠病和炎症相关性结直肠癌的诊断和治疗过程中的应用提供了理论支持。