论文部分内容阅读
植物病毒病是由植物病毒引起的对农业生产造成严重影响的一类重要病害,目前尚未有高效的抗病毒制剂,尤其是天然抗病毒制剂来防治植物病毒病。研究发现食用菌中含有许多具有独特功能的生物活性蛋白,如核糖体失活蛋白(RIP)、抗动植物病毒蛋白、凝集素等,它们具有很强的抗肿瘤、抗动植物病毒、抗真菌、免疫调节等生物活性,这为日益严重的植物病毒病害提供了新的防治途径。Y3是从食用菌毛头鬼伞(Coprinus comatus)中发现的对烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)具有一定抑制作用的蛋白,此蛋白呈碱性,在体外稳定性高,利于开发,具有潜在的应用价值。本试验对其基因序列及原核、真核表达特性进行了研究,其结果如下:(1)通过克隆得到一段1000bp的蛋白y3基因的全长DNA序列和530bp的cDNA序列。利用NCBI中的BLAST同源检测,发现DNA序列只有与抗TMV蛋白Y3部分DNA序列有最大的同源性,GenBank登录号为HM204931.1,最大同一性(Max identity)为94%;cDNA序列则包括1个最大长度为393 bp的ORF,该最大ORF推测可编码1个含有130个氨基酸的多肽链,将其与NCBI上的蛋白y3部分cDNA序列进行比对,一致性达到95.69%。同时比对y3基因的DNA序列和c DNA序列,发现二者序列的同一性(Identity)达89.96%,几乎完全配对,说明本试验所得到的两种序列具有很高的同源性,进一步说明本试验得到的DNA和cDNA序列均是目的序列。(2)设计带有限制性酶切位点Bamh1和Xho1的引物,以获得的530bp的cDNA序列为模板进行PCR,再将PCR产物与载体PET28a(+)连接构建原核表达载体PET28a(+)-y3,诱导表达的蛋白经纯化后采用半叶法测定其抗病毒活性,表明当y3蛋白浓度为12.5μg/ml时,对TMV侵染抑制率为70.22%+1.25%,说明本试验通过原核表达得到的y3蛋白液还是具有比较好的抗TMV活性的,但是低于直接从毛头鬼伞子实体中提取的y3蛋白的抗TMV活性,说明原核表达系统存在着一定的不足和缺陷,还需要进一步探索更好的蛋白表达系统。(3)以带有酶切位点SnaBⅠ和NotⅠ的序列为引物,以获得的530bp的cDNA序列为模板进行PCR,将获得的目的片段与T-载体连接、转化、提取后再与真核表达载体pPic9k连接转化入酵母感受态细胞,经甲醇诱导表达后得到抗TMV蛋白Y3。通过摸索接种比例、甲醇浓度、pH值、摇床转速、诱导时间等培养条件对蛋白Y3表达的影响,经过正交试验优化确定了较优发酵条件:将Mut+转化子接种于BMGY生长培养基上,培养至OD600=5.0,离心后以1.5:1的接种比例转移到含有1.0%甲醇,pH值为6.0的BMMY诱导培养基中。300rmp,30℃,诱导培养5天,每隔24h添加1.0%的甲醇。结果表明优化后Y3表达量约40.7mg/L,比优化前的24.5mg/L提高了将近1倍。目的蛋白经SDS-PAGE电泳,大小约为14.4kD,证明目的蛋白即为Y3。采用半叶法测定Y3蛋白的抗病毒活性,显示Mut+转化子表达产物对TMV的平均抑制率为83.7%,而对照组仅为25.74%。结果表明,Mut+转化子的表达产物有显著的抗病毒活性。