论文部分内容阅读
研究背景和目的肝细胞性肝癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是比较常见的消化道恶性肿瘤,发病率和死亡率居高不下,早期不表现明显临床症状,部分患者仅显示轻微消化道反应,发展迅速,多数伴有肝硬化,多数患者确诊时为晚期或已发生远处转移,一般对症支持治疗方法效果有限,且手术后生存期较短。近些年纳米医学的发展为多模态可视化诊治肝癌提供了有效方法,多功能纳米医学在生物成像、荧光标记、可视化诊疗等方面发挥着不可替代的作用。光敏剂作为多功能纳米医学的代表之一,其在光动力治疗中有着不可替代的作用。BODIPY作为一种荧光染料,因其高效的单线态氧产生率、良好的光谱性能、稳定的光化学性质、良好的生物荧光成像以及温和的合成路线等特点,成为光动力治疗的代表。光动力治疗可与化疗、分子靶向、光热、免疫治疗等联合发挥作用,满足临床对肿瘤联合治疗的需要。目前,已有第三代多功能纳米诊疗剂应用于肿瘤的联合治疗,但由于其生物相容性与安全性的限制,影响了其在肿瘤治疗方面的作用。仑伐替尼（Lenvatinib）作为一种分子靶向药物,可抑制病理性血管生成,从而调控肿瘤进展。本文拟设计并构建一种具有良好生物相容性及安全性的BODIPY-仑伐替尼纳米粒子,协同光动力治疗与分子靶向治疗,研究其对于肝癌的作用以及作用机制。研究方法（1）根据已报道文献,设计合成光敏剂BDPBr2和BDPCl2,核磁氢谱和质谱表征其结构,紫外可见吸收光谱、荧光光谱测定其光化学物理特性;（2）以两亲性聚合物Pluronic F127包封BODIPY与分子靶向药物仑伐替尼,合成功能性纳米粒子LBPNPs（LBBr2 NPs和LBCl2 NPs）,测试其表征:紫外可见吸收光谱仪测试紫外可见吸收光谱;荧光分光光度仪测试荧光发射光谱;用紫外可见分光光度计分别测量LBBr2 NPs和LBCl2 NPs对BDPBr2、BDPCl2和仑伐替尼的载药量;粒径分析仪测试粒径大小、粒径稳定性以及Zeta电位;透射电镜观察其结构,扫描电镜观察其形貌,并且测定在不同p H条件下仑伐替尼的药物释放率,以及测定LBPNPs单线态氧的产生;（3）使用LBPNPs干预Hep3B和Huh7肝癌细胞,检测ROS产生;（4）运用MTT法比较BDPBr2、BDPCl2、仑伐替尼、LBBr2 NPs和LBCl2 NPs对肝癌细胞Hep3B和Huh7的毒性,同时计算IC50值,进行药物毒性的验证;进行细胞凋亡水平检测;相关凋亡蛋白表达水平检测,探索其协同治疗的作用机制。结果（1）核磁氢谱和质谱结果显示,卤素原子Br与Cl成功引入BODIPY母核,紫外可见吸收光谱和荧光光谱进一步验证了BDPBr2和BDPCl2良好的光化学物理特性,BDPBr2和BDPCl2分别在524nm和521nm处显示吸收峰值,同时其相对荧光量子产率为0.82和0.75;（2）紫外可见吸收光谱和荧光光谱结果显示,BDPBr2、BDPCl2和仑伐替尼成功组装在LBBr2 NPs和LBCl2 NPs中,LBBr2 NPs和LBCl2 NPs对仑伐替尼的载药率分别为11.8±0.31%和10.2±0.24%,LBBr2 NPs和LBCl2 NPs对BDPBr2和BDPCl2的载药率分别为5.8±0.12%和4.9±0.14%;DLS结果显示LBBr2 NPs和LBCl2 NPs的粒径大小分别为75±1.6 nm和85±2.4 nm,且15天内稳定性较好,SEM和TEM结果显示LBBr2 NPs和LBCl2 NPs在水溶液中均匀分布,呈现均一的球形,直径分别约为78nm和85nm;Zeta电位结果显示,LBBr2 NPs和LBCl2 NPs的Zeta电位分别为-29±0.8 m V和-33.17±1.5 m V;药物释放实验表明LBBr2 NPs和LBCl2 NPs在酸性环境中仑伐替尼的释放率可达80%以上;单线态氧结果显示LBPNPs可在660nm激光照射下产生单线态氧,且产率较高;（3）使用LBPNPs干预Hep3B和Huh7肝癌细胞后,在660nm激光照射下,荧光显微镜检测肝癌细胞可有效生成ROS;（4）MTT实验显示LBBr2 NPs和LBCl2 NPs在光照条件下,对Hep3B和Huh7肝癌细胞的IC50值分别为16.2 ug/m L、17.9 ug/m L和15.8 ug/m L、17.7 ug/m L;流式细胞检测表明LBBr2 NPs和LBCl2 NPs在光照条件下,显著诱导Hep3B和Huh7肝癌细胞凋亡（P＜0.0001）;Western Blot检测结果显示在光照条件下,使用LBBr2 NPs和LBCl2 NPs处理Hep3B和Huh7肝癌细胞,caspase-3、caspase-9和BAX促凋亡蛋白的表达明显增高,Bcl-2和Bcl-xl抑制凋亡蛋白的表达显著减少,证明了光动力与分子靶向的协同治疗作用是通过促进caspase级联反应诱导肿瘤细胞死亡。结论本文设计并构建了两种BODIPY（BDPBr2和BDPCl2）,与仑伐替尼自组装,并通过聚合物Pluronic F127的包封,形成功能性纳米粒子LBPNPs（LBBr2 NPs和LBCl2 NPs）,具有较好的稳定性及光化学物理特性,提高了BODIPY光敏剂的生物相容性与安全性,同时减少了仑伐替尼的用药剂量,表明了光动力与分子靶向协同治疗的效果,给临床诊疗肝癌提供了新思路。