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采用PCR技术扩增猪抵抗素基因(Retn)cDNA片段,将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建真核表达载体pcDNA3.1-Retn,将其注射入小鼠体内,研究重组resistin与糖代谢和脂代谢的关系。
用PCR方法从含有猪Retn基因cDNA的质粒pMD18T-Retn中扩增Retn基因片段,将其克隆至pcDNA3.1(+)表达载体中,获得重组质粒pcDNA3.1-Rein。采用Lipofectamin 2000转染Hela细胞,用G418筛选稳定表达的Hela细胞株。RT-PCR检测结果表明,Retn基因在Hela细胞中得到了转录:用Tricine-SDS-PAGE和Westernblot方法在电泳凝胶和硝酸纤维素膜上检测到分子量大小约为12.0 kD的特异性蛋白条带,该蛋白条带可与resistin抗体特异性结合,表明Retn基因在Hela细胞中得到表达。采用碱裂解法大量提取重组质粒pcDNA3.1-Retn和空质粒pcDNA3.1(+),并采用聚乙二醇法纯化。
将120只昆明小鼠随机分为4组,试验Ⅰ组每只注射pcDNA3.1-Retn 50μg、试验Ⅱ组每只注射pcDNA3.1-Retn 100μg、试验Ⅲ组每只注射pcDNA3.1-Retn 150μg、对照组每只注射pcDNA3.1(+)100μg,每10d注射1次,共注射3次。每次注射后10d每组随机取小鼠8只,摘眼球采血,检测血液生化指标。
结果表明:
1、注射后不同时期试验组血糖水平较对照组明显升高。第Ⅱ组与对照组相比:第10d差异显著(p<0.05);第30d,差异极显著(p<0.01);第20d,血糖水平虽有提高但差异不显著(p>0.05)。
2、各试验组血清游离脂肪酸水平与对照组相比较具有降低的趋势。第20和30d,第Ⅱ组分别比对照组降低38.8%(p<0.05)和29.1%(p<0.05)。
3、各组甘油三酯水平在第10、20、30d时差异均未达到显著水平(p>0.05),但各试验组组较对照组略有升高。
4、第10、20d各组间血清总胆固醇水平差异不显著(p>0.05),但第30d,第Ⅱ组与对照组相比差异极显著(p<0.01)。
5、注射pcDNA3.1-Retn能降低血清高密度脂蛋白水平。第10d,第Ⅱ组显著低于对照组(p<0.05);第20、30d各试验组组与对照组相比较差异均达到极显著水平(p<0.01)。
6、各组血清低密度脂蛋白相比较差异均未达到显著水平(p>0.05),但第20、30d各试验组低于对照组。
7、注射pcDNA3.1-Retn能降低血清脂肪酶活力水平。在第20d,第Ⅱ组极显著低于对照组(p<0.01)。
综上所述,本研究已成功构建猪Retn基因真核表达载体pcDNA3.1-Retn,并在体外哺乳动物细胞中得到表达,表达产物resistin蛋白具有生物学活性。体内试验研究结果表明:resistin参与了胰岛素抵抗的形成,影响体内糖代谢和脂代谢。本研究结果为进一步研究resistin生物学功能奠定了基础。