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背景与目的:蛋白酶激活受体2(PAR2)属于新的G蛋白偶联受体家族,并含有7个跨膜区。类胰蛋白酶、胰酶和凝血酶能够影响中性粒细胞的功能。但是,很少报道这些蛋白酶对中性粒细胞乳铁蛋白和IL-8释放的影响。本文研究了类胰蛋白酶、胰酶、凝血酶和弹性蛋白酶,PAR1的激动肽SFLLR-NH2和PAR2的激动肽SLIGKV-NH2和tc-LIGRLO-NH2对高度纯化的人中性粒细胞乳铁蛋白和IL-8释放的影响。流式细胞仪表明中性粒细胞表达PAR1和PAR2的蛋白,不表达PAR3和PAR4的蛋白。RT-PCR分析表明中性粒细胞只表达PAR2的基因。类胰蛋白酶和胰酶能诱导大量乳铁蛋白和IL-8的释放,而凝血酶和弹性蛋白酶却不能。SLIGKV和tc-LIGRLO-NH2也能诱导中性粒细胞乳铁蛋白和IL-8的释放,但SFLLR-NH2却没有效应。总之,中性粒细胞表达PAR1和PAR2,类胰蛋白酶和胰酶很可能通过激活PAR2引起乳铁蛋白和IL-8的释放。 因此,PAR2在中性粒细胞的激活中起着重要的作用,这对治疗激活的中性粒细胞引起的相关疾病具有重要的意义。 方法:1.流式细胞仪分析PARs的表达:为了检测PAR1和PAR2的表达,100μl全血和高度纯化的人中性粒细胞用鼠抗人的CD16-PE、PAR1-FITC和PAR2-FITC的单克隆抗体4℃孵育30分钟,然后用2ml流式裂解液裂解10分钟,用PBS(1%FCS)洗2次。为了检测PAR3和PAR4的表达,100μl全血和高度纯化的人中性粒细胞用兔抗人的PAR3和PAR4的多克隆一抗4℃孵育15分钟,加羊抗兔的IgG-FITC二抗4℃孵育30分钟,然后用2ml流式裂解液裂解10分钟,PBS(1%FCS)洗2次。然后用0.5ml的PBS悬浮待检测。 2.人的外周血中性粒细胞的分离:30ml全血用Ficoll-paque分离。将15mlFicoll-paque加入50ml离心管中,然后将30ml全血缓缓加入,500×g无滞动离心30分钟,弃掉血浆和单个核细胞层,吸取红细胞上的粒细胞层,残余的红细胞用裂解缓冲液(155mM NH4CL,10mM KHCO3,0.1mM EDTA)裂解5-7分钟,用PBS(含有1%的FCS)洗2次,中性粒细胞悬浮在含有2%FCS和1%Pen/Strep的1640培养基中。中性粒细胞的纯度用流式细胞仪鉴定为>95%,用胎盼蓝染色鉴定其活度>98%。 3.逆转录PCR反应分析PARs mRNA的表达:中性粒细胞的RNA用Trizol法提取。1μg的总RNA进行逆转录反应,42℃30分钟,99℃5分钟,5℃5分钟。然后进行PCR反应,94℃2分钟,94℃30秒,67℃30秒,72℃1分钟,72℃10分钟,35个循环。PCR的扩增产物用荧光绿染色并在1.5%的琼脂糖胶上电泳。β-actin作为阳性对照,其扩增条件为94℃2