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背景与目的：蛋白酶激活受体2（PAR2）属于新的G蛋白偶联受体家族，并含有7个跨膜区。类胰蛋白酶、胰酶和凝血酶能够影响中性粒细胞的功能。但是，很少报道这些蛋白酶对中性粒细胞乳铁蛋白和IL-8释放的影响。本文研究了类胰蛋白酶、胰酶、凝血酶和弹性蛋白酶，PAR1的激动肽SFLLR-NH2和PAR2的激动肽SLIGKV-NH2和tc-LIGRLO-NH2对高度纯化的人中性粒细胞乳铁蛋白和IL-8释放的影响。流式细胞仪表明中性粒细胞表达PAR1和PAR2的蛋白，不表达PAR3和PAR4的蛋白。RT-PCR分析表明中性粒细胞只表达PAR2的基因。类胰蛋白酶和胰酶能诱导大量乳铁蛋白和IL-8的释放，而凝血酶和弹性蛋白酶却不能。SLIGKV和tc-LIGRLO-NH2也能诱导中性粒细胞乳铁蛋白和IL-8的释放，但SFLLR-NH2却没有效应。总之，中性粒细胞表达PAR1和PAR2，类胰蛋白酶和胰酶很可能通过激活PAR2引起乳铁蛋白和IL-8的释放。 因此，PAR2在中性粒细胞的激活中起着重要的作用，这对治疗激活的中性粒细胞引起的相关疾病具有重要的意义。 方法：1．流式细胞仪分析PARs的表达：为了检测PAR1和PAR2的表达，100μl全血和高度纯化的人中性粒细胞用鼠抗人的CD16-PE、PAR1-FITC和PAR2-FITC的单克隆抗体4℃孵育30分钟，然后用2ml流式裂解液裂解10分钟，用PBS（1％FCS）洗2次。为了检测PAR3和PAR4的表达，100μl全血和高度纯化的人中性粒细胞用兔抗人的PAR3和PAR4的多克隆一抗4℃孵育15分钟，加羊抗兔的IgG-FITC二抗4℃孵育30分钟，然后用2ml流式裂解液裂解10分钟，PBS（1％FCS）洗2次。然后用0.5ml的PBS悬浮待检测。 2．人的外周血中性粒细胞的分离：30ml全血用Ficoll-paque分离。将15mlFicoll-paque加入50ml离心管中，然后将30ml全血缓缓加入，500×g无滞动离心30分钟，弃掉血浆和单个核细胞层，吸取红细胞上的粒细胞层，残余的红细胞用裂解缓冲液（155mM NH4CL，10mM KHCO3，0.1mM EDTA）裂解5-7分钟，用PBS（含有1％的FCS）洗2次，中性粒细胞悬浮在含有2％FCS和1％Pen／Strep的1640培养基中。中性粒细胞的纯度用流式细胞仪鉴定为＞95％，用胎盼蓝染色鉴定其活度＞98％。 3．逆转录PCR反应分析PARs mRNA的表达：中性粒细胞的RNA用Trizol法提取。1μg的总RNA进行逆转录反应，42℃30分钟，99℃5分钟，5℃5分钟。然后进行PCR反应，94℃2分钟，94℃30秒，67℃30秒，72℃1分钟，72℃10分钟，35个循环。PCR的扩增产物用荧光绿染色并在1.5％的琼脂糖胶上电泳。β-actin作为阳性对照，其扩增条件为94℃2