子宫内膜异位症(Emdometriosis,EM),简称内异症,是指具有生长功能的子宫内膜腺体和间质出现在子宫腔被覆黏膜及宫体肌层以外的雌激素依赖性疾病。EM发病率约占育龄期女性的6%～10%,其中约20%-50%的患者合并有不孕,而不明原因不孕患者中EM患者可高30%-50%。内异方为治疗EM及EM不孕的有效复方,在治疗EM性不孕症方面取得了较好的临床疗效,但其确切的作用机制尚不明确。目的:本课题主要研究EM性不孕症患者卵泡液对颗粒细胞凋亡的影响及内异方干预机制,采用腹腔注射方法建立EM小鼠模型,探讨中药内异方对EM模型小鼠生殖能力的影响,并从卵泡发育、颗粒细胞凋亡角度探讨内异方的作用机制。方法:收集行IVF-ET的EM性不孕症、输卵管因素不孕患者卵泡液,配置成浓度为9%卵泡液分别加入体外培养的输卵管因素不孕患者颗粒中培养48h,采用流式细胞法检测各组颗粒细胞凋亡率,进行组间比较分析。在体外培养的输卵管因素致不孕患者的颗粒细胞中同时加入浓度为9%EM性不孕症患者卵泡液和10%的内异方药物血清,体外干预48h,采用流式细胞法检测颗粒细胞凋亡率,通过RTPCR、Western Blotting检测各组颗粒细胞线粒体凋亡途径中关键基因及蛋白Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9、P53表达情况。采用腹腔注射方法建立EM小鼠模型,造模术后2周,随机选取10只小鼠,剖腹探查异位灶生长情况。剩余小鼠按随机数字表随机分为孕三烯酮组(n=31)、内异方组(n=31)、模型组(n=31),各组分别用孕三烯酮、内异方、生理盐水连续灌胃30天。停止干预后每组随机选取15只EM小鼠按雌雄比3:1合笼,连续合笼15天后,取出雄鼠,每天早上8点定时观察并统计各组小鼠产仔数,进行组间比较分析。通过阴道脱落细胞涂片观察EM小鼠,每组随机选取6只小鼠于动情前期处死并取其卵巢组织,石蜡包埋切片,其中一侧用于观察卵巢组织形态学变化分析各组卵泡育情况,另一侧用于后续探讨颗粒细胞凋亡蛋白表达情况。剩余每组10只小鼠,于动情前期,脱颈处死,取其卵巢组织,提取颗粒细胞进行体外培养,细胞贴壁后48h,通过流式细胞法检测颗粒细胞凋亡率。采用免疫组化法检测颗粒细胞凋亡过程中关键蛋(Casepase-3、Casepase-9、Bax、p53、Bcl-2)表达情况,探讨内异方对EM模型小鼠颗粒细胞抗凋亡作用机制。结果:(1)EM组凋亡率显著高于空白组、输卵管组(P<0.01);输卵管组与空白组比较差异无统计学意义。(2)内异方血清组颗粒细胞凋亡率低于对照组和正常血清组(P<0.05);对照组与正常血清组比较,差异无统计学意义;凋亡蛋白及基因Casepase-3、Casepase-9、Bax、p53m RNA在颗粒细胞表达方面,内异方血清组较其它2组表达下降,抗凋亡蛋白及基因Bcl-2表达水平升高,正常血清组与对照组之间,差异不明显。(3)采用腹腔注射法建立EM小鼠模型,成功率100%;生殖能力方面,内异方组妊娠率为100%,高于孕三烯酮组和模型组(86.7%);产仔数结果显示,内异方组与孕三烯酮组、模型组分别比较均具有显著差异,P<0.001,孕三烯酮组与模型组比较,差异无统计学意义;各级卵泡计数结果显示:3组小鼠各级卵泡构成,具有显著差异(P<0.001),内异方组始基卵泡、窦前卵泡和窦状卵泡构成比均大于模型组和孕三烯酮组,闭锁卵泡构成比均小于模型组和孕三烯酮;内异方组颗粒细胞凋亡率明显低于孕三烯酮组与模型组降低(P<0.05),孕三烯酮组与模型组之间差异无统计学意义;内异方组抗凋亡蛋白Bcl-2较孕三烯酮组、模型组阳性表达水平增高(P<0.01),Caspese-3、Caspese-9、P53、Bax均表达水平下降(P<0.05)。结论:子宫内膜异位症性不孕症卵泡液能显著诱导颗粒细胞凋亡,中药内异方能通过上调抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平,下调凋亡蛋白Casepase-3、Casepase-9、Bax、p53的表达,调控线粒体凋亡途径,减少颗粒细胞凋亡,促进卵泡发育,提高EM模型小鼠生殖能力。