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多波长反常散射法目前已成为研究蛋白质晶体结构非常广泛的一项方法。本文克隆到脂肪芽孢杆菌Bacillusstearothermophilus中的耐热对硝基酚磷酸酶(thermostablep-nitrophenylphosphatase，TNPPase)基因，将其编码区连接到pQE30表达载体中，在E.coliM15中经IPTG诱导得到高效表达。Mg2+、Mn2+和Co2+对TNPPase的活性有一定的促进作用，而Zn2+和Ni2+对TNPPase没有影响。该酶是中度耐热蛋白质，金属离子有助于提高其热稳定性。确定耐热对硝基酚磷酸酶是金属酶蛋白，活性部位含有镁离子。采用气相悬滴扩散法进行200个结晶条件的筛选和优化，在众多结晶条件中优化培养得到的TNPPase(0.4×0.3×0.1mm3)。通过初步的X射线衍射结构测定，并对数据进行结构解析，获得了耐热对硝基酚磷酸酶TNPPase的晶胞参数。应用基因工程技术，将TNPPase分子中的甲硫氨酸(Met)全部置换为甲硒氨酸(SeMet)。培养出甲硒氨酸置换的耐热对硝基酚磷酸酶(SeMet-TNPPase)的晶体。同步辐射光源收集SeMet-TNPPase晶体的X射线衍射数据，应用多波长反常散射方法解析出TNPPase的晶体结构。PDB蛋白结构库搜寻结果表明我们所得到的TNPPase晶体结构是一个未报道的全新结构。每个单体由结合比较紧密的两个结构域组成，两个结构域的一级结构有交叉。晶体结构中有9个标准的α螺旋、3个310螺旋，以及16个β折叠和24个β转角。α结构域和β结构域紧凑得折叠形成典型的似Rossmann折叠(Rossmman-likefold)。确定酶活性中心为9-12位保守序列DLDG。并根据晶体结构提出了该耐热酶耐热的机理。该项研究可为解释耐热蛋白质耐热机制的研究提供帮助。