TMEM16A对高肺血流性肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖作用及机制研究

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目的:研究跨膜蛋白16A(TMEM16A)对高肺血流性肺动脉高压大鼠肺动脉平滑肌细胞(pulmonary artery smooth muscle cells,PASMCs)的增殖作用及可能的调控通路。方法:将30只体重为180-220g的SD大鼠随机分为正常组、假手术组、分流组。分流组大鼠采用腹主动脉-下腔静脉分流造瘘的方法建立高肺血流性肺动脉高压大鼠模型,假手术组大鼠开腹后予夹闭腹主动脉血流10分钟处理,正常组大鼠不做任何处理。同条件下饲养11周后通过右心室压力、右心室肥厚指数、肺小动脉HE染色评估模型建立成功情况,无菌条件下分别提取3组大鼠的肺动脉平滑肌细胞进行原代培养,用qRT-PCR及Western Blot检测TMEM16A的mRNA及蛋白表达情况,用Western Blot检测PCNA、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK的蛋白表达水平,用细胞增殖实验(CCK8试剂盒法)检测细胞增殖的情况。再取分流组细胞分别通过病毒转染和加入AKT通路抑制剂(LY294002)及ERK通路抑制剂(U0126)将其分为分流组、空载病毒组、慢病毒沉默组、分流+LY294002组、分流+U0126组。用Western Blot检测TMEM16A、PCNA、AKT、p-AKT、ERK、p-ERK的蛋白表达水平,用细胞增殖实验(CCK8试剂盒法)检测细胞增殖的情况。结果:通过右心室压力、右心室肥厚指数、肺小动脉HE染色检测高肺血流性肺动脉高压大鼠模型建立成功。qRT-PCR结果显示分流组TMEM16A mRNA较正常组表达明显升高,差异有统计学意义(P0.05)。Western Blot结果显示分流组TMEM16A、PCNA、p-AKT、p-ERK蛋白表达水平较正常组明显升高,差异有统计学意义(P0.05);慢病毒沉默组TMEM16A、PCNA、p-AKT、p-ERK较分流组明显降低,差异有统计学意义(P0.05);分流+LY294002组PCNA、p-AKT、p-ERK的蛋白表达水平较分流组下降(P<0.05),分流+U0126组PCNA、p-ERK蛋白表达水平较分流组下降(P0.05)。细胞增殖实验结果提示分流组肺动脉平滑肌细胞的OD值在48小时及之后时间节点较正常组明显升高,差异有统计学意义(P0.05);慢病毒沉默组肺动脉平滑肌细胞的OD值在48小时及之后时间节点较分流组均明显下降(P0.05),分流+LY294002组、分流+U0126组肺动脉平滑肌细胞的OD值在加入抑制剂24小时及之后较分流组均下降(P<0.05)。结论:(1)TMEM16A在高肺血流性肺动脉高压大鼠PASMcs上高表达,通过促进PASMCs增殖,参与高肺血流性肺动脉高压的发病机制。(2)TMEM16A通过激活高肺血流性肺动脉高压大鼠PASMCs中EKR和AKT的磷酸化,促进高肺血流性肺动脉高压大鼠PASMCs增殖,参与肺血管重构。
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