目的:结直肠癌是常见的恶性肿瘤,其预后较差,生存率低,其中结直肠癌的浸润转移是术后复发和导致患者死亡的重要原因。结直肠癌转移是一个多因素、多阶段、多步骤的复杂生物学过程,癌细胞对肿瘤内部缺氧微环境的耐受与适应是发生转移的基础。转录因子缺氧诱导因子-1α（hypoxia inducible factor-1 alpha,HIF-1α）作为感受不同氧环境下氧分压的中枢调控子,除调节细胞内氧稳态外,尚能够调节相关基因的转录活性,积极参与肿瘤的侵袭、转移等病理生理过程。因其作用机制复杂,目前仍缺乏深入了解。为此,本课题在既往对结直肠癌侵袭转移研究的基础上,探讨肿瘤发生发展过程中HIF-1α与FasL的表达,以期进一步了解结直肠癌的侵袭转移机制,为临床防治提供新的靶点与理论依据。方法:1.采用分子克隆方法,将我室已构建的FasL-pcDNA3.1（+）质粒与pcDNA3.1（-）质粒进行重组,得到新的FasL-pcDNA3.1（-）质粒并进行鉴定。通过脂质体转染法将空质粒、FasL-pcDNA3.1（+）与FasL-pcDNA3.1（-）质粒分别转染人直肠癌HR-8348细胞,构建侵袭力不同的结直肠癌细胞HR-8348_L、HR-8348_F和HR-8348_As并加以鉴定;以未转染细胞HR-8348_B为空白对照,观察细胞形态,检测各组细胞的侵袭能力与增殖速度。2.采用化学缺氧法构建四组直肠癌HR-8348细胞缺氧模型,免疫细胞化学方法检测各组细胞缺氧12h后HIF-1α表达水平,计算阳性表达百分率;Western blot方法定量检测缺氧0h、6h、12h及24h各组细胞内HIF-1α的表达;并在缺氧12h时相下,应用流式细胞仪测定各组细胞周期的分布,MTT法测定各组细胞增殖能力的改变,TUNEL法测定各组细胞凋亡状况。3.采用免疫组织化学方法,对120例结直肠癌组织及癌旁组织、30例结肠腺瘤组织及28例结直肠癌肝转移组织中HIF-1α与FasL的表达情况进行检测,并分析HIF-1α表达与结肠癌临床病理特征和FasL水平之间的关系。结果1.新构建质粒FasL-pcDNA3.1（-）符合要求,FasL酶切片断及PCR片断大小正确,测序正确率为99.2%;各质粒转染成功,RT-PCR方法可分别自HR-8348_F细胞和HR-8348_As细胞中得到FasL和As-FasL片断;倒置显微镜下观察各组细胞,见HR-8348_F细胞异型性更明显;单层细胞体外侵袭实验见HR-8348_F细胞穿透Transwell滤膜的细胞数目为12.930±2.434,显著多于HR-8348_B、HR-8348_L和HR-8348_As细胞（分别为8.133±1.959,7.670±2.093和7.870±1.685）（P＜0.05）;HR-8348_B、HR-8348_L、HR-8348_F和HR-8348_As细胞的群体倍增时间分别为28.3h、41.0h、24h和35.4h。2.缺氧12h后,HR-8348_F细胞HIF-1α蛋白阳性率为76.0%,显著高于HR-8348_B、HR-8348_L和HR-8348_As细胞（分别为48.5%,43.0%和39.5%）（P＜0.05）,而后三组细胞间无显著性差异（P＞0.05）。Western blot检测示HIF-1α蛋白于120kD处显色;比较不同缺氧时相各组细胞内HIF-1α的表达水平,缺氧0h与6h,各组样品中HIF-1α表达微量;缺氧12h,HR-8348_F细胞内HIF-1α水平较0h和6h时明显增高（P＜0.05）,而HR-8348_B、HR-8348_L及HR-8348_As细胞内HIF-1α表达与6h时无明显变化（P＞0.05）;缺氧24h,HR-8348_F细胞内HIF-1α表达仍处于较高水平,但与缺氧12h表达量比较差别不显著（P＞0.05）,HR-8348_B、HR-8348_L及HR-8348_As细胞内HIF-1α表达水平则较缺氧12h略有下降,但不具备统计学意义（P＞0.05）;组间比较,缺氧0h、6h时各组细胞HIF-1α蛋白水平无显著性差异（P＞0.05）,缺氧12h、24h HR-8348_F细胞HIF-1α水平显著高于HR-8348_B、HR-8348_L及HR-8348_As细胞（P＜0.01）。测定缺氧状态下的细胞生物学特性,见HR-8348_F细胞的增殖指数（60.43±3.61）显著高于HR-8348_B、HR-8348_L和HR-8348_As细胞（40.01±3.22,41.30±3.96和35.87±4.28）（P＜0.05）,增殖抑制率和凋亡指数（17.30±2.08和13.10±1.06）显著低于HR-8348_B、HR-8348_L、HR-8348_As细胞（33.70±4.56和21.60±1.33,34.20±4.12和20.10±1.17,38.00±4.79和23.90±1.25）（P＜0.05）。3.HIF-1α阳性率在结直肠癌旁粘膜中为5.8%（7/120）,在结肠腺瘤组织中为20.0%（6/30）,在结直肠癌原发灶和转移灶中分别为71.7%（86/120）和89.3%（25/28）;癌原发灶和肝转移灶中HIF-1α的表达水平显著高于腺瘤和癌旁组织（P＜0.01）,腺瘤组织中HIF-1α水平亦高于癌旁粘膜组织（P＜0.05）,而癌原发灶与肝转移灶中HIF-1α水平无明显差异（P＞0.05）。FasL的阳性表达率在癌旁粘膜、结肠腺瘤、癌原发灶和肝转移灶中分别为15.0%（18/120）、23.3%（7/30）、69.2%（83/120）和100.0%（28/28）;癌原发灶和转移灶中FasL的表达水平明显高于腺瘤和癌旁组织（P＜0.01）,而腺瘤和癌旁组织中、癌原发灶与肝转移灶中FasL水平均无显著性差异（P＞0.05）。结直肠癌原发灶中HIF-1α的表达水平与患者性别、年龄、病理组织学类型及分化程度无关（P＞0.05）,而与区域淋巴结转移状况及Dukes分期密切相关（P＜0.05）。发生肝转移患者的癌原发灶中HIF-1α和FasL阳性表达率分别为92.9%（26/28）和85.7%（24/28）,与无肝转移组（分别为65.2%,60/92和64.1%,59/92）相比均差异显著（P＜0.01）;HIF-1α与FasL的表达强度有等级相关性（r=0.924,P＜0.01）。结论:1.应用分子克隆技术将正义FasL片断转染入结直肠癌细胞内可构建具有高侵袭力的细胞,结直肠癌细胞内FasL的表达强度与其侵袭能力呈正相关;2.结直肠癌细胞内FasL表达增强可促进缺氧状态下细胞HIF-1α表达增高,促进细胞对微环境缺氧的适应,导致细胞的增殖加速,凋亡减少,侵袭能力进一步增强;3.结直肠癌组织中HIF-1α的表达水平与FasL水平呈正相关,并与肿瘤细胞的生物学行为关系密切,HIF-1α表达水平可作为预测结直肠癌侵袭转移情况的参考指标之