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目的：探究人β-防御素3(human β-defensin 3,hBD3)在牙龈卟啉单胞菌内毒素(Porphyromonasgingivalislipopolysaccharide,Pg-LPS)血症产生的炎症反应和促动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)病变中的作用;研究hBD3在Pg-LPS促巨噬细胞炎症反应中的作用;探索hBD3在AS病变最初阶段血管内皮细胞活化的影响。方法:1.hBD3对Pg-LPS内毒素血症炎症水平和促AS中的作用:体内实验中,使用32只ApoE基因敲除(ApoE-/-小鼠,构建慢性Pg-LPS内毒素血症模型,随机分为4组,即NC组、Pg-LPS组、Pg-LPS+hBD3组、hBD3组。在到达实验节点时,首先取小鼠全血,测血常规;随后,对小鼠进行安乐死,取小鼠血清及主动脉壁组织进行ELISA和定量聚合酶链式反应(Quantitative polymerase chain reaction,Q-PCR)检测;油红O染色、免疫组化染色、弹力纤维染色等组织病理学方法观察hBD3干预对AS病变形成的影响。2.hBD3对Pg-LPS刺激下巨噬细胞炎症反应的影响:体外实验用Pg-LPS刺激RAW 264.7小鼠巨噬细胞,并使用不同浓度的hBD3进行干预,ELISA法检测上清中炎症因子的表达;基因芯片方法检测hBD3处理后表达发生变化的基因和通路;免疫印迹的方法验证基因芯片结果中通路的变化情况。3.hBD3对肿瘤坏死因子(tumornecrosisfactor,TNF)-α诱导的原代人脐静脉内皮细胞(human primary umbilical vein endothelial cells,HUVECs)活化的影响:用TNF-α刺激体外培养的HUVEC,并使用不同浓度的hBD3进行处理,ELISA法检测上清中表达的炎症因子和趋化因子水平;应用DCFH-DA检测胞内活性氧(reactiveoxygenspecies,ROS)的产生;鬼笔环肽染色细胞骨架;免疫印迹检测与细胞粘附、信号通路和凋亡相关蛋白水平。结果:1.hBD3对Pg-LPS内毒素血症炎症水平和促AS中的作用:体内实验中,hBD3显著抑制了 ApoE-/-小鼠Pg-LPS慢性炎症模型中血清单核细胞趋化蛋白(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)和可溶性细胞间粘附分子(solubleintercellularadhesionmolecular-1,sICAM-1)的升高。此外,QPCR 结果显示,hBD3的干预显著降低了 Pg-LPS诱导下ApoE-/-小鼠动脉壁细胞间粘附分子(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)和血管细胞间粘附分子(vascularadhesionmolecule-1,VCAM-1)的表达。血常规结果表明,hBD3 逆转了 Pg-LPS刺激引起的ApoE-/-小鼠淋巴细胞/单核细胞比率(lymphocyte monocyte ratio,LMR)下调。而在AS病变方面,hBD3不仅显著下调了血清中总胆固醇(total cholesterol,TC)和低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)水平,而且显著改善了 Pg-LPS内毒素血症促动脉粥样硬化病变的形成,表现为,内膜下巨噬细胞浸润减少,血管壁内-中膜厚度降低,以及主动脉根部和主动脉树斑块形成减少。2.hBD3对Pg-LPS刺激下巨噬细胞炎症反应的影响:体外实验中,hBD3明显抑制了 Pg-LPS刺激下RAW 264.7小鼠巨噬细胞产生的TNF-α和IL-6,并且呈浓度依赖性。此外,hBD3也能显著抑制Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)-2激动剂Pam3CSK4和TLR4激动剂MPLA引起的RAW 264.7巨噬细胞TNF-α上调。基因芯片结果表明,hBD3的干预显著抑制了 Pg-LPS刺激下RAW264.7细胞一些炎症基因的表达上调。此外,30min内,hBD3呈浓度依赖性地抑制了丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路中 p38 和细胞外信号调节激酶(extracellular-signal regulated protein kinase,ERK)的磷酸化水平。3.hBD3对TNF-α诱导的HUVEC活化的影响:首先,hBD3显著并浓度依赖性地抑制了 TNF-α 诱导下 HUVEC 中白介素(interleukin,IL)-6、IL-8、MCP-1 和巨噬细胞迁移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)的产生。此外,hBD3明显减少了 HUVEC细胞内ROS的产生。其次,免疫印迹分析显示,hBD3呈浓度依赖性地降低了 TNF-α引起的HUVEC表面ICAM-1和VCAM-1的表达,因此,hBD3也抑制了单核细胞与TNF-α刺激的内皮细胞之间的粘附。另外,hBD3也逆转了炎症下HUVEC细胞骨架的重组。最后,通路分析显示,hBD3通过减少IKK、IκB和p65的磷酸化从而抑制了NF-κ活性;通过抑制p38和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal protein kinase)的磷酸化抑制MAPK通路的活化。结论:hBD3能显著抑制炎症刺激下巨噬细胞炎症反应和内皮细胞活化,对ApoE-/-小鼠血管壁炎性损伤和AS病变的形成具有一定的保护作用。