白癜风是一种常见的原发性的、获得性的皮肤色素脱失性皮肤、粘膜疾病,以大小不等、数目不定的色素完全脱失斑为典型皮损。目前认为其发病是多基因遗传的、在多种内外因子的激发下表现为免疫功能紊乱,导致表皮黑素细胞破坏,终至色素脱失。彻底阐明白癜风的发病机制特别是免疫机制对于探索到治疗白癜风的新靶点有着非常重要的意义。在白癜风中尽管存在自身免疫异常的证据,但是导致针对黑素细胞自身抗原的细胞和体液免疫是如何触发的问题仍有待解决。根据Matzinger的危险信号学说,体内的细胞损伤等危险信号可激活APC来活化适应性免疫反应,在白癜风自身免疫反应的触发期,往往存在皮肤黑素细胞生物学特性的异常,例如,外源性机械刺激、烧伤、过度紫外线照射以及化学物质的刺激会导致局部黑素细胞处于应激状态,而这种应激状态是否导致黑素细胞的免疫学特性发生改变,从而激发或者放大随之而来的针对黑素细胞抗原的适应性自身免疫反应,还需要的研究证实。但是毋庸置疑的是黑素细胞的天然免疫特性可能在联结黑素细胞应激反应与自身免疫免疫反应中起到了重要的桥梁作用。近年来对黑素细胞的研究,特别是对其生物学特性及细胞生化方面的研究已经较为深入,许多证据都表明黑素细胞与皮肤免疫系统之间有密切联系。体外培养的黑素细胞表面可以表达MHC-Ⅰ/Ⅱ分子、粘附分子ICAM-1、VCAM-1及Fc受体等免疫分子,并且能够被IFN-γ和TNF-α上调表达；黑素细胞自身还能分泌细胞因子IL-1、IL-6、IL-8和TGF-β等细胞因子,认为黑素细胞是皮肤免疫系统的重要成员,并且可能以更加主动的方式参与并调节免疫反应。TLRs被认为只表达在免疫细胞和多种炎症细胞表面,如树突状细胞(Dendritic cells, DC)、巨噬细胞和T、B淋巴细胞等,与其相应的配体结合后可以激活免疫细胞使其分泌大量的促炎性细胞因子和趋化因子,参与活化天然免疫应答和特异性免疫应答,构成机体免疫系统的第一道防线。近年来,有报道指出除免疫细胞外,多种组织细胞也表达TLRs,例如皮肤角质形成细胞表达不同的TLRs,与TLRs相应配体结合后被激活,分泌大量的细胞因子和趋化因子。由上述关于白癜风发病机制和TLRs生物学功能的研究,我们设想：黑素细胞可以表达功能性TLRs, TLRs与其内外源性配体结合后引发黑素细胞生物学及免疫学表型和功能的变化,这种变化很可能与白癜风自身免疫反应的发生和发展有着密切的联系。尽管这种联系存在着诸多疑问。一旦这些疑问得到解决,我们将发现一个新颖的角度解释白癜风的发病机制,并有希望将该通路作为新的治疗靶点应用于白癜风的临床治疗。原代培养细胞24h后开始贴壁,可见角质形成细胞间散在的多级树突状细胞,大部分细胞胞体圆而小,有两个对称树突,突起长短不等；少数细胞胞体大,呈多角形,有2个至数个树突。约14天后可传代,根据角质形成细胞和黑素细胞对胰酶的不同耐受性和成纤维细胞不能耐受G418的特性可分离出纯黑素细胞。显微镜下可见系胞质及树突呈棕褐色或黑色,多巴染色结果呈阳性。我们采用RT-PCR法对体外培养的第三代黑素细胞进行鉴定,结果显示,角质形成细胞特异性标记分子keratin 10和keratin 14,成纤维细胞的特异性标记分子ASO2均不能被扩增,证明用上述培养传代方法制备的第三代黑素细胞纯度较好,可用于进行下一步试验。为了定性证明各TLRs成员在黑素细胞上的表达,我们以体外培养的第三代黑素细胞为对象,并且以正常人外周血PBMC作为阳性对照,采用RT-PCR法检测到mRNA水平表达的TLR1,2,3,4,6,7以及9,未检测到TLR5,8和10。我们采用间接免疫荧光标记和流式细胞术在蛋白水平证明黑素细胞上TLR2,4,7和9的表达。为了揭示黑素细胞上表达的TLR3的亚细胞定位,我们采用间接免疫荧光和流式细胞术对黑素细胞膜上和胞内可能存在的TLR3进行检测。结果证实：黑素细胞上表达的TLR3主要定位于细胞内。为了进一步证实TLR3的表达,我们用Western blot方法对TLR3进行了免疫印迹检测。结果显示：PVDF膜在TLR3的位置上出现了特异性的染色条带,大小为100 kD左右,与文献报道的人TLR3分子量相符合。为排除黑素细胞培养条件对TLR3表达的影响,我们采用荧光免疫组织化学法检测了TLR3在皮肤组织中的原位表达。结果证实,NKI/beteb作为特异性标志显示黑素细胞位于表皮真皮交界处,并可以观察到黑素细胞上TLR3的表达。上述结果显示,人表皮黑素细胞可以组成性表达TLR3,因此接下来讨论TLR3的表达是否可以被其特异性配体Poly(I:C)诱导。在不同浓度Poly(I:C)作用后6h,TLR3 mRNA开始上调表达,其上调倍数分别为：2.7(1μg/ml),4.2(10μg/ml)以及3.6 (100μg/ml)。在Poly I:C作用24小时后,TLR3上调表达倍数分别为3.8 (1μg/ml),13(10μg/ml)以及37(100μg/ml),并明显剂量依赖性。这些结果证明TLR3可以被其配体刺激上调表达,黑素细胞表达的TLR3具有一定生物学功能。我们在前述工作中已证明黑素细胞表达TLR家族的众多成员,为了验证这些TLR是否也具有相应的功能,首先,我们检测了黑素细胞在TLR活化条件下促炎性细胞因子IL-8和IL-6的分泌情况。结果显示：针对TLR2,3,4,7和9的激活剂都可以诱导IL-8分泌量显著提高,其中以TLR3激活剂poly(I:C)最强烈。黑素细胞在用PGN,poly(I:C),LPS以及CpG 2006刺激时,IL-6分泌水平明显升高,但在用imiquimod作为刺激物刺激黑素细胞上表达的TLR7时,并没有发现IL-6分泌水平的变化。趋化因子在吸引免疫细胞浸润改变皮肤局部免疫格局中发挥重要作用。接下来我们采用real-time PCR法检测了TLR活化后趋化因子CCL2/MCP-1, CCL3/MIP-1和CCL5/RANTES。结果显示,在不同TLR激活剂刺激下,黑素细胞分泌各种趋化因子格局各有不同。所有的TLR配体都可以显著诱导CCL3 mRNA的表达,同时CCL2和CCL5也有不同程度的表达增高,但TLR7配体imiquimod无此效应。在前面的结果中,我们证明了TLR活化可以诱导炎性细胞因子和趋化因子的释放,接下来我们将验证NF-κB信号通路的活化是否介导了TLR活化诱导黑素细胞炎性细胞因子和趋化因子的分泌。首先,我们用western blot检测磷酸化IκBα水平。结果证实：不同TLR配体处理黑素细胞后,磷酸化IκBα蛋白水平都有不同程度的升高。NF-κB活化后即发生核转位,由胞质转移至胞核。为了进一步证实NF-κB信号通路的激活,我们应用间接免疫荧光检测胞质及胞核内NF-κBp65水平。结果证实：未受刺激的黑素细胞,p65亚基几乎只分布在胞质内,TLR不同配体刺激后,黑素细胞胞质内p65蛋白明显下降,而胞核内p65蛋白则显著上调。为观察TLR3配体dsRNA对黑素细胞的影响,我们利用phalloidin荧光染料对细胞骨架蛋白actin进行染色,结合相差显微镜观察黑素细胞形态变化。结果发现,用poly(I:C)作用于黑素细胞后,细胞形态由梭形或多角形变为扁平形,树突逐渐消失。台盼兰拒染实验显示,随着poly(I:C)剂量的增加,黑素细胞存活率逐渐降低,呈剂量依赖性。Hoechst33258细胞核染色结果显示,对照组细胞核荧光呈淡蓝色且着色较均一,而poly(I:C)作用后的黑素细胞核呈特征性亮蓝色荧光,并可观察到细胞核固缩及团块状的凋亡小体。收集poly(I:C)作用的黑素细胞,抽取细胞总DNA进行琼脂糖凝胶电泳,结果显示：与正常对照组细胞基因组DNA相比,poly(I:C)作用的黑素细胞DNA呈明显的ladder,提示有凋亡细胞的存在。进一步用Annexin-V/PI双染色结合流式细胞术检测黑素细胞凋亡情况,dsRNA作用后,显示早期凋亡信号(Annexin V+/PI-)的黑素细胞数量(22%)明显多于对照抗体组(2.5%),说明dsRNA在可以在体外诱导黑素细胞凋亡。我们通过前期的结果证实了dsRNA对黑素细胞的促凋亡作用,为了进一步证实这种效应由TLR3介导,我们应用慢病毒载体稳定表达针对TLR3的shRNA,抑制原代培养的黑素细胞中TLR3的表达。采用western blot法检测TLR3蛋白水平的变化。结果显示：通过慢病毒载体稳定转染shTLR3的黑素细胞,其TLR3表达水平显著下降,而转染随机对照shRNA对TLR3表达水平并无影响。随后我们用流式细胞术检测下调TLR3表达的黑素细胞的凋亡情况。结果显示：稳定转染了shTLR3的黑素细胞受到poly(I:C)刺激后,其凋亡率明显降低,证明了TLR3介导了dsRNA对黑素细胞的促凋亡效应。为验证NF-κB通路的活化是否与dsRNA诱导黑素细胞凋亡有关我们进而采用NF-κB特异性阻断剂Bay11-7082作用于TLR3激活下的黑素细胞,用westernblot检测磷酸化IκBα水平。结果显示：TLR3活化后上调的磷酸化IκBα水平,Bay11-7082有一定的抑制作用,进而检测dsRNA对黑素细胞的促凋亡效应。Bay11-7082虽然能够部分抑制NF-κB的活化,但对于dsRNA诱导的黑素细胞凋亡却没有抑制作用,同时我们用TLR4的配体LPS刺激黑素细胞,发现LPS不能明显抑制黑素细胞凋亡。因为LPS是已知的NF-κB强诱导剂,所以以上结果证实,NF-κB通路并没有参与TLR3活化诱导的黑素细胞凋亡。TLR3活化诱导的干扰素释放对于机体抗病毒反应具有重要意义,同时有文献报道Ⅰ型干扰素,包括IFN-a和IFN-p,在某些细胞中可以诱导凋亡途径的激活,因此,在我们下一步研究中,我们分析了Ⅰ型干扰素在TLR3活化介导的黑素细胞凋亡中的可能作用。我们用TLR3配体dsRNA刺激黑素细胞后,取培养上清,用ELISA法分别检测Ⅰ型IFN即IFN-α和IFN-β的分泌。结果证实,受到dsRNA刺激进而TLR3活化之后,IFN-α和IFN-β的分泌水平显著提高。用western blot方法检测了TLR3活化后STAT1磷酸化的水平,结果显示：dsRNA处理黑素细胞2小时后,磷酸化STAT1水平显著升高。为了进一步确证Ⅰ型IFN与黑素细胞凋亡的关系,我们使用特异性识别IFN-α和IFN-β的中和性抗体分别作用于黑素细胞,并用dsRNA刺激TLR3活化,结果发现：IFN-β中和性抗体能够强烈抑制poly(I:C)诱导下的黑素细胞凋亡,而IFN-α中和性抗体没有此效应。为了进一步证明IFN-β分泌与黑素细胞凋亡之间的关系,我们运用不同浓度IFN-β中和性抗体作用于黑素细胞,结果发现,随着使用的抗体浓度增高,其抑制黑素细胞凋亡的效应也不断增强。以上结果证明了黑素细胞自分泌的IFN-p在TLR3活化诱导的黑素细胞凋亡中的作用,进一步,我们分析了外源性加入的IFN-a或IFN-β是否能直接影响黑素细胞凋亡。结果显示：外源性加入的IFN-α、IFN-β没有显著影响黑素细胞的生存率。以上结果证明,IFN-β参与了TLR3活化诱导的黑素细胞凋亡,但IFN-β本身不能直接诱导黑素细胞凋亡。细胞的凋亡在体内受到多条信号通路的影响,已报道在TLR活化中,MAPK途径发挥重要作用,所以在下一步的研究中我们将分析MAPK成员p38,ERK1／2和JNKl／2在dsRNA的促IFN-p分泌以及凋亡效应中的作用。我们用poly(I：C)与黑素细胞共孵育后,采用western blot检测p38,ERK1／2和JNKl／2的磷酸化情况。结果显示：poly(I:C)作用后,磷酸化p38、磷酸化ERK1／2和磷酸化JNK1／2水平都有不同程度上调。为了证明活化的p38,ERK1／2和JNKl／2,是直接与dsRNA的促凋亡效应相关,还是仅为TLR3活化的伴随效应,我们采用特异性的阻断剂对p38, ERK1／2以及JNKl／2信号通路分别进行了阻断后,检测TLR3活化对黑素细胞凋亡的影响。结果显示：用p38特异性阻断剂SB203580与poly(I:C)同时作用后,黑素细胞凋亡率下降了73.6%,用ERK1／2特异性阻断剂U0126作用后,黑素细胞凋亡率下降了50%,而用JNK1／2阻断剂SP600125作用后,不影响黑素细胞的凋亡率,以上结果证明,在TLR3活化诱导的黑素细胞凋亡过程中,p38和ERK1／2通路可能发挥一定的作用。为了进一步证实以上结果,我们将p38、ERK1／2以及JNKl／2通路阻断后,在形态学上观察TLR3活化对黑素细胞凋亡的影响,结果证实：对p38和ERK1／2的阻断可以部分逆转TLR3活化导致的黑素细胞凋亡,而阻断JNK1／2途径无此效应。阻断p38和ERK1／2都可以显著抑制poly(I:C)刺激下的IFN-β释放,阻断JNK1／2无明显作用。以上结果证实,p38和ERK1／2通路参与了TLR3活化介导的IFN-β分泌与黑素细胞凋亡。综上所述,本课题证实人表皮黑素细胞在mRNA水平蛋白水平组成性表达TLR2,3,4,7和9的表达。这些TLR受其特异性配体刺激后,黑素细胞合成表达促炎性细胞因子和趋化因子的水平升高。我们发现黑素细胞表达的TLR3活化后可以诱导黑素细胞凋亡,这种凋亡效应依赖于IFN-β的自分泌,并受信号通路p38和ERK1／2的影响。基于以上结果,我们推测黑素细胞表达的TLR3很可能与白癜风自身免疫反应的发生和发展有着密切的联系。黑素细胞可以通过表达TLR3直接识别病毒代谢中产物dsRNA或坏死细胞释放的dsRNA,从而改变了黑素细胞的免疫学表性和生物学功能,激发或放大针对黑素细胞自身抗原的免疫反应。如果这一假设得到证实,将会帮助我们从一个新颖的角度解释白癜风的发病机制,并有希望从该通路入手寻找新的治疗靶点应用于白癜风的临床治疗。