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目的:建立人骨髓间充质干细胞(hMSCs)的体外培养和成骨诱导体系。研究hMSCs表面抗原的表达情况,以及体外传代培养和成骨诱导对表面抗原的影响。评价体外传代培养对hMSCs增殖能力和凋亡的影响。研究地塞米松对hMSCs增殖、ALP表达和凋亡的影响。观察经体外扩增、成骨诱导hMSCs的体内成骨能力,评价其经皮注射修复小段骨缺损的疗效。 方法:1.hMSCs的体外培养:抽取红骨髓,离心收集细胞,以1.073g/mL的Percoll分离液梯度密度离心,取单个核细胞于培养箱内孵育,观察细胞形态、生长曲线和细胞周期。2.hMSCs的成骨诱导:将hMSCs以含有地塞米松、抗坏血酸和β-甘油磷酸钠的OS液培养,观察形态学改变,分别行碱性磷酸酶(ALP)染色、Ⅰ型胶原和骨钙素的免疫组化染色及钙化结节Von Kossa染色,并定量测定ALP活性。3.取不同培养代数和不同诱导天数的hMSCs,流式细胞仪检测细胞表面抗原的表达情况。4.取不同继代的hMSCs,分别检测增殖能力,并通过流式细胞仪检测其凋亡率。5。地塞米松对hMSCs的影响:以不同浓度地塞米松处理hMSCs,分别检测MTT增殖率、ALP活性和凋亡率。6.动物实验:抽取兔骨髓,以Percoll分离液离心纯化,取MSCs体外培养扩增至所需数量,以OS液诱导成骨分化,将其经皮注射植入自体兔骨缺损,以自体红骨髓移植入对侧缺损作为对照,放射学、组织学、形态剂量学分析和生物力学检测缺损的修复情况。 结果:1.体外培养的hMSCs贴壁生长,呈长梭形,细胞器少,可增殖形成克隆,经OS液诱导后细胞呈多角形,胞浆内含丰富的粗面内质网、线粒体和溶酶体等,可重叠生长。hMSCs大部分处于静止期,只有24.6%处于分裂周期,生长曲线为典型的S形曲线。经成骨诱导后,hMSCs ALP染色、胶原和骨钙素组化染色、钙化结节染色阳性,对照组均为阴性。2.hMSCs阳性表达CD29、CD44、CD71、CD90、CD105、CD166,但CD14、CD34、CD38、CD45呈阴性。CD71、CD90、CD166的阳性表达率在成骨诱导时出现不同程度的下降,但每种抗原在不同继代之间的差异无统计学意义。成骨诱导可显著增加ALP活性,于诱导第12d达高峰,为未诱导组的4-5倍,诱导组和对照组不同继代ALP活性的差异均无统计学意义。3.随传代次数的增加,hMSCs的增殖能力逐渐下降,凋亡率升