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脓毒症(Sepsis)是严重创伤、烧伤、休克、外科大手术后较为常见的并发症,进一步发展可导致脓毒性休克、多器官功能障碍综合征(MODS)等,已成为临床危重病患者的重要死亡原因之一。越来越多的研究表明,内皮细胞在LPS引起的内毒素休克、多器官功能衰竭等病理过程中起着重要的作用。因此,深入研究LPS激活内皮细胞机制具有非常重要的意义。内皮细胞本身不表达mCD14,LPS对内皮细胞的激活需sCD14的参与,由sCD14将LPS传递给内皮细胞膜上的LPS跨膜受体TLR4,转导LPS信号。然而进一步研究却发现,TLR4对LPS的信号转导尚需MD-2的参与。关于MD-2的功能,目前大多数研究采用基因转染LPS无反应细胞,探讨MD-2在LPS对细胞激活和信号转导中的作用,但对于其在人内皮细胞的作用方面的研究甚少。 因此,本研究在成功分离、培养人脐静脉内皮细胞的基础上观察了人内皮细胞MD-2的表达及LPS对其表达的影响,并对MD-2在LPS与内皮细胞的结合以及MD-2在LPS激活/损伤内皮细胞和信号转导通路中的作用,IFN-γ对内皮细胞TLR4、MD-2表达的影响进行了初步研究。初步阐明了MD-2在LPS激活/损伤内皮细胞的机制和信号转导通路中的作用,为深入研究和阐明LPS作用机制奠定基础,最终为在细胞水平上为G-菌脓毒症、脓毒性休克的防治提供新靶点、新思路和新捷径。主要研究结果和结论如下:一、RT-PCR和Western blot 检测结果显示,人内皮细胞能表达MD-2mRNA和MD-2蛋白,且LPS能明显上调其表达水平,呈一定的时间和剂量依赖关系。初步说明MD-2在LPS激活内皮细胞效应中具有重要作用。二、血清能明显促进不同剂量LPS与HUVEC的结合,尤其是小剂量LPS。TLR4抗体、MD-2抗体能分别显著减少LPS与HUVEC的结合,且减少程度与抗体剂量呈依赖关系。表明内皮细胞上与LPS结合的受体是TLR4-MD-2,MD-2在LPS与内皮细胞的结合中起着不可缺少的重要作用。三、转染MD-2的功能突变体能明显抑制LPS对内皮细胞的激活,呈剂量依赖性。本课题受国家973项目(G1999054203)科研基金资助<WP=10>提示,MD-2在LPS激活内皮细胞效应中具有重要的地位。四、IFN-γ能明显上调内皮细胞TLR4、MD-2的表达,并且TLR4、MD-2表达的增加与IFN-γ呈一定的剂量依赖关系。说明IFN-γ是通过上调内皮细胞上的LPS受体-TLR4、MD-2促进LPS对内皮细胞活化的。