肿瘤血管生成在肿瘤的生长、演进及转移等方面有着重要的作用,因此,针对肿瘤的抗血管生成具有重要意义。恶性胶质瘤由于生长部位的特殊性及生长的侵袭性,外科手术根治难度大,而放疗和化疗效果亦不理想。因此,针对胶质瘤的抗血管生成治疗则显得尤为重要。肿瘤微血管中主要有内皮细胞和其周围的周细胞,目前的抗血管生成药物主要针对内皮细胞,比如Bevacizumab和Sunitinib等。研究表明,这些药物在多种肿瘤中都取得了较好的治疗效果。然而,在一些体积较大的肿瘤中,这些药就达不到理想的结果。这是因为针对内皮细胞的治疗会使微血管密度下降,但是血管的周细胞覆盖率反而上升了。因此,周细胞也应是抗血管生成治疗的靶细胞。研究周细胞在血管中的作用对同时针对内皮细胞和周细胞的抗血管生成治疗具有重要的意义。周细胞与内皮细胞作用,能稳定新形成的内皮细胞小管,能调节血流和血管的通透性,调节内皮细胞的增殖、分化、迁移和存活。周细胞能分化为多种间质细胞。如在血管增大过程中,周细胞可分化为血管平滑肌细胞;在损伤修复及炎症过程中,周细胞可从血管壁脱落,分化为能产生Ⅰ型胶原的纤维母细胞样细胞;另外,有报道称周细胞能分化为纤维母细胞,成骨细胞,软骨细胞及脂肪细胞。周细胞的来源多样,并且,在不同的组织器官,其来源也有区别。周细胞标志物在不同的物种、不同的组织中会有不同,在不同的发育阶段也会有差异。目前,可作为鉴定周细胞的标记物主要有NG2、RGS5、PDGFRβ、desmin、α-SMA、3G5神经节苷脂、Slug、XlacZ4及氨基肽酶N等。众所周知,肿瘤组织间质与正常组织间质明显不同,这种不同也包含了肿瘤微血管周细胞。为了能更好地研究肿瘤微血管周细胞,需要一个能特异表达在其上的分子。而新近研究表明,CD248/Endosialin/TEM1是一个在肿瘤微血管周细胞上高表达的分子,而在正常组织微血管周细胞上并不表达。这就为更好研究肿瘤微血管周细胞提供了可能。CD248是单次跨膜糖蛋白,已发现了四个与其作用的配体,分别是纤维连接蛋白、Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原及转移相关蛋白Mac-2BP/90K。在胚胎发育过程中,CD248表达在各种组织(肺、肾、脾、肝等)间质纤维母细胞及血管上。并且,随着胚胎的发育,CD248的表达逐渐下降。在成体组织中,CD248在子宫及肾小球中表达较高,输卵管血管也有少量表达,心、肺表达更低,而其他组织则几乎不表达。另外,在内皮祖细胞中,也可见CD248表达。CD248在多种肿瘤中均有表达,如肉瘤,脑肿瘤,乳腺癌,皮肤癌、结肠癌等。在本研究中,我们首先利用新鲜标本冰冻切片,进行兔抗人CD248抗体和鼠抗人CD31抗体及兔抗人CD248抗体和鼠抗人α-SMA抗体免疫荧光双标,证实CD248的确是胶质瘤微血管周细胞特异表达的标志物。其次,利用118例石蜡组织切片,研究CD248的表达在胶质瘤中的临床病理意义。为了更好研究CD248在肿瘤血管生成中的作用,我们利用CD248特异表达在肿瘤微血管周细胞上的特点,结合免疫磁珠的方法,分离胶质瘤微血管周细胞,并经免疫组织化学、免疫荧光和RT-PCR的方法得到验证。随后利用慢病毒转染CD248干扰序列到周细胞,经免疫荧光、RT-PCR、Western blot的方法验证干扰效果;用划痕实验及细胞增殖实验观察CD248对周细胞的影响。在周细胞CD248干扰前后对肿瘤血管生成的影响实验中,把CD248干扰前后的周细胞分别与U87细胞混合后注入裸鼠皮下,观察肿瘤大小及肿瘤血管生成情况。最终确认CD248为针对肿瘤微血管周细胞的抗血管生成治疗的一个良好靶点。主要结果一、CD248特异表达在胶质瘤微血管周细胞上,且其表达与患者性别、年龄无关,而与胶质瘤的分级相关。在12例人脑原代胶质瘤新鲜标本中,对其中8例高表达CD248的标本进行CD248和CD31及CD248和α-SMA免疫荧光双标染色。结果显示,CD248表达在细胞膜上,CD31也表达在细胞膜上,但是两者表达在不同的细胞上。CD248阳性细胞在CD31阳性细胞的周围。α-SMA表达在细胞浆内,它与CD248表达在相同的细胞上。由于CD31为内皮细胞标记,而α-SMA为周细胞标记,因此,上述结果表明:CD248表达在胶质瘤微血管周细胞上,而不表达在微血管内皮细胞上。因此,可以把CD248作为胶质瘤微血管周细胞的一个特异性标记分子。为了更好地了解CD248在胶质瘤周细胞中的表达情况,我们对118例胶质瘤标本进行免疫组织化学检测,发现WHOⅠ级6例均不表达,Ⅱ级39例中有15例表达(表达率38.46%),Ⅲ级37例中有26例表达(表达率70.27%)、Ⅳ级36例中有27例表达(表达率75%)。Ⅱ级胶质瘤与Ⅰ级胶质瘤相比,无显著差异(P>0.05);Ⅲ级、Ⅳ级胶质瘤与Ⅰ级、Ⅱ级胶质瘤相比,均有非常显著差异(P<0.01);而Ⅲ级、Ⅳ级胶质瘤之间CD248的表达无显著差异(P>0.05)。二、成功分离、培养和鉴定了胶质瘤微血管周细胞。我们运用兔抗人CD248多克隆抗体标记胶质瘤微血管周细胞,再运用免疫磁珠的方法,获得了一群细胞。免疫组化染色结果显示,这群细胞表达CD248,不表达内皮标记分子CD31及胶质细胞标记GFAP。免疫荧光结果显示,原代培养的胶质瘤中仅含有少量CD248阳性细胞,大部分为GFAP阳性的胶质瘤细胞。免疫磁珠分离后所得到的细胞,大部分为CD248阳性细胞。在分离得到的细胞中,CD248与PDGFR-β共表达于细胞膜上,也与NG2共表达在细胞膜上。分离所得的周细胞纯度为91.0±5.6%。RT-PCR结果显示,分离所得细胞的条带长度约为230bp,与预计的条带吻合,即分离所得细胞含有CD248的mRNA。在ECM胶中,周细胞能形成小管样结构;在三维支架中,周细胞能沿着胶原支架生长,形成小管结构。三、发现下调CD248表达可抑制周细胞增殖和迁移。利用CD248shRNA慢病毒颗粒感染周细胞。免疫荧光染色显示,与对照组相比,CD248shRNA干扰后的周细胞CD248表达明显下调;RT-PCR结果显示,CD248干扰后的周细胞mRNA大约下降了50%;Western blot结果表明,CD248干扰后的周细胞CD248的表达明显下降。抑制CD248的功能后,周细胞的迁移能力明显下降;干扰CD248分子在周细胞上的表达后,亦能明显降低周细胞的迁移能力。细胞增殖实验结果显示,与对照组相比,CD248干扰后,周细胞增殖能力明显下降。四、证实了CD248参与胶质瘤移植瘤血管生成。下调周细胞CD248表达后,与U87细胞一起注入裸鼠皮下。结果显示,与对照组相比,肿瘤体积缩小(P=0.022),血管密度下降(P=0.021),具有显著统计学意义,但微血管直径没有统计学意义(P=0.769)。这说明CD248促进周细胞参与肿瘤血管生成。可能机制为CD248与细胞外基质中的纤维连接蛋白、Ⅰ型胶原、Ⅳ型胶原作用,促进周细胞增殖,使周细胞分泌基质金属蛋白酶9,引起血管外基质的降解,利于周细胞和内皮细胞的迁移,进而形成更多的新生血管。五、CD248活化后能促进周细胞招募相关受体的表达,推测其在周细胞上的作用与周细胞招募有关。转移相关蛋白Mac-2BP/90K刺激对照组周细胞后,TGFRβⅠ,TGFRβⅡ,PDGFRβ,EDG-1在mRNA水平上均有大幅上升,尤其是在刺激后12小时达到顶峰。而Mac-2BP/90K刺激CD248干扰后的周细胞后,TGFRβⅠ,TGFRβⅡ,EDG-1在mRNA水平上未见明显升高,仅PDGFRβmRNA有一定的升高。周细胞的招募在肿瘤血管生成中具有重要作用,因此,CD248的激活,能促进肿瘤的血管生成。上述结果表明,CD248在肿瘤中的高表达与肿瘤恶性程度有关,它具有促进肿瘤血管生成的作用,抑制CD248的表达后,周细胞增值、迁移能力下降,肿瘤血管生成减少。因此,CD248可作为抗肿瘤血管生成的一个靶点。