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心房颤动(房颤)是临床上最常见的快速型心律失常,其发病机制复杂,心房重构是其中的中心环节。心房重构包括电重构和结构重构,研究表明电重构可以逆转,而结构重构则难于逆转或仅能部分逆转。心房纤维化是心房结构重构最主要的病理改变,因此,探索心房纤维化的机制,阻断心房结构重构,将为房颤的治疗提供新的、有效的手段。血小板衍生生长因子(Platelet derived growth factor,PDGF)是重要的致纤维化因子,通过与血小板衍生生长因子受体(Platelet derived growth factor receptor,PDGFR)结合,激活下游信号通路,刺激心脏成纤维细胞分泌细胞外基质,而在心肌纤维化中起着重要作用。微小核糖核酸(microRNAs,miRNAs)是一类内源性非编码小分子RNA,通过与靶基因mRNA的3’非翻译区(3’-Untranslated Region,3’-UTR)结合,在转录后水平调节蛋白质的合成。多个miRNA被证明参与了心房纤维化的病理生理过程,生物信息学预测编码 PDGF-B 的 PDGFB 是 miRNA-590-3p 调控的靶基因,但 miRNA-590-3p是否通过调控PDGF-B信号通路而参与房颤心房纤维化的病理生理过程,尚未见文献报道。本研究将采用实时定量聚合酶链反应(real time quantity polymerase chain reaction,RT-qPCR)、免疫印迹(Western-blot)、免疫组化(Immunohistochemical,IHC)检测房颤和窦性心律(窦律)患者右心耳miRNA-590-3p、PDGF-B、血小板衍生生长因子受体β亚基(Platelet derived growth factor receptor β,PDGFR-β)、Ⅰ 型胶原(Collagen type Ⅰ,COL1)mRNA及蛋白表达,Masson染色观察右心耳胶原纤维沉积。建立快速心房起搏房颤犬模型,检测不同房颤时程犬左、右心耳,左、右心房miRNA-590-3p、PDGF-B和PDGFR-β mRNA及蛋白表达变化。采用双荧光素酶报告基因检测系统进行miRNA-590-3p靶基因验证。应用外源性PDGF-BB及PDGFR酪氨酸酶激酶抑制剂(AG1295)干预大鼠心房成纤维细胞,探讨miRNA-590-3p调控的PDGF-B/PDGFR-β信号通路在房颤心房纤维化中的作用,为房颤发病机制的研究提供新的思路。研究结果显示:1.(1)房颤患者右心耳组织miRNA-590-3p表达水平明显下调,而COL1表达水平明显上升,胶原纤维沉积增多。(2)房颤犬左、右心耳,左、右心房组织miRNA-590-3p表达水平随房颤时间的延长呈下降趋势,至房颤第二周后维持在较低的表达水平;COL1的表达水平则随着房颤时间的延长逐渐上升。(3)房颤犬心房胶原纤维增生表现出空间上的各向异性,以右心耳、右心房胶原纤维增生更为明显。2.(1)房颤患者右心耳PDGF-B、PDGFR-β的表达水平明显升高。(2)房颤犬左、右心耳,左、右心房PDGF-B表达水平随着房颤时间的延长进行性增加,PDGFR-β表达水平在房颤初期无变化,自房颤第2周起逐渐上调。3.(1)双荧光素酶报告基因检测表明PDGFB是miRNA-590-3p直接调控的靶基因;(2)PDGF-BB促进大鼠心房成纤维细胞COL1分泌,并呈现浓度依赖性和时间依赖性,AG1295可以减轻上述效应。以上结果提示,miRNA-590-3p下调在心房纤维化发生的过程中起着重要作用。miRNA-590-3p下调对PDGF-B的抑制作用减弱,使得PDGF-B/PDGFR-β信号通路过度激活,促进心房成纤维细胞分泌细胞外基质,导致心房纤维化。第一部分miRNA-590-3p在心房颤动心房纤维化中的作用研究目的探讨miRNA-590-3p在房颤心房纤维化中的作用。方法72例开胸心脏手术患者,分为房颤组(39例),窦律组(33例)。RT-qPCR检测两组患者右心耳miRNA-590-3p和COL1 mRNA表达水平,Western-blot及IHC检测COL1蛋白表达和空间分布,Masson染色观察右心耳胶原纤维沉积情况。构建快速心房起搏房颤犬模型,分为正常对照组、假手术组、房颤1周组、房颤2周组和房颤4周组,每组4只。采用RT-qPCR检测各组犬左、右心耳,左、右心房miRNA-590-3p和COL1 mRNA表达水平,Western-blot及IHC检测COL1蛋白表达水平和空间分布,Masson染色观察犬心房胶原纤维沉积情况。结果1.房颤组患者右心耳miRNA-590-3p表达水平(0.7981±0.5422)明显低于窦律组患者(1.6123±1.1132)(P<0.05)。2.房颤组患者右心耳COL1 mRNA表达水平(3.2719±2.0143)明显高于窦律组患者(1.7813±0.8255),(P<0.05);蛋白表达水平(0.6524±0.2097)亦明显高于窦律组患者(0.3123±0.1218)(P<0.05)。3.房颤组患者右心耳胶原纤维沉积明显多于窦律组患者,房颤组胶原容积分数(32.83%±8.07%)明显高于窦律组(11.07%±4.02%)(P<0.01)。4.(1)房颤犬左、右心耳和左、右心房miRNA-590-3p表达水平随着房颤时间的延长呈下降趋势,至第2周后维持在较低水平;(2)房颤2周后,右心耳和右心房miRNA-590-3p表达水平低于左心耳和左心房(P<0.05)。5.(1)房颤犬左、右心耳和左、右心房COL1 mRNA和蛋白表达水平随着房颤时间的延长进行性上升;(2)房颤2周后,右心耳和右心房COL1 mRNA和蛋白表达水平高于左心耳和左心房(P<0.05)。6.(1)随着房颤时间的延长,房颤犬心房胶原纤维沉积逐渐增加(P<0.05);(2)房颤第2周时可观察到明显的胶原纤维沉积,且以右心耳和右心房更为明显(P<0.05)。结论(1)房颤患者、房颤犬均存在明显的心房纤维化,并且伴有miRNA-590-3p表达水平明显下调,提示miRNA-590-3p下调可能在房颤心房纤维化的病理生理过程中起着重要作用。(2)房颤犬心房胶原纤维增生表现出空间上的各向异性。第二部分PDGF-B/PDGFR-β3信号通路在心房颤动心房纤维化中的作用研究目的探讨PDGF-B/PDGFR-β3信号通路在房颤心房纤维化中的作用。方法72例开胸心脏手术患者,分为房颤组(39例),窦律组(33例)。RT-qPCR和Western-blot分别检测两组患者右心耳PDGF-B和PDGFR-βmRNA和蛋白表达水平,IHC检测PDGF-B和PDGFR-β空间分布。构建快速心房起搏房颤犬模型,分为正常对照组、假手术组、房颤1周组、房颤2周组和房颤4周组,每组4只。采用RT-qPCR和Western-blot检测各组犬左、右心耳,左、右心房PDGF-B和PDGFR-β mRNA和蛋白表达水平,IHC检测PDGF-B和PDGFR-β空间分布。结果1.房颤组患者右心耳PDGF-B mRNA表达水平(2.5675±2.3481)明显高于窦律组(1.5674±0.8314)(P<0.05);蛋白表达水平(0.8074±0.2407)亦明显高于窦律组(0.3806±0.1049)(P<0.01)。2.房颤组患者右心耳PDGFR-β mRNA表达水平(2.0112±1.6320)明显高于窦律组患者(1.3566±0.7931)(P<0.05);蛋白表达水平(0.4044±0.1818)亦明显高于窦律组患者(0.1950±0.0841)(P<0.01)。3.房颤犬左、右心耳,左、右心房PDGF-B mRNA和蛋白表达水平随着房颤时间的延长进行性上升。4.房颤犬左、右心耳,左、右心房PDGFR-β3 mRNA和蛋白表达水平在房颤初期无变化,自房颤第2周起逐渐上调。结论房颤患者、房颤犬心房PDGF-B和PDGFR-β表达水平增加,提示PDGF-B/PDGFR-β信号通路过度激活在房颤心房纤维化中起着重要作用。第三部分miRNA-590-3p-PDGF-B-PDGFR-β信号通路在心房颤动心房纤维化调控中的机制研究目的探讨miRNA-590-3p-PDGF-B-PDGFR-β信号通路参与房颤心房纤维化调控的机制。方法构建人miRNA-590过表达质粒、miRNA阴性对照质粒、PDGF-B 3’-UTR报告质粒和PDGF-B 3’-UTR结合位点突变报告质粒载体。分为miRNA-590-3p组(miRNA-590过表达质粒与PDGF-B 3’-UTR报告质粒共转染人293T细胞)、miRNA阴性对照组(miRNA阴性对照质粒与PDGF-B 3’-UTR报告质粒共转染人293T细胞)、突变组(miRNA-590过表达质粒与PDGF-B 3’-UTR结合位点突变报告质粒共转染人293T细胞)和突变对照组(miRNA阴性对照质粒与PDGF-B 3’-UTR结合位点突变报告质粒共转染人 293T 细胞),48h 后收集细胞,检测 Gaussia Luciferase(Gluc)及 SEAP活性。提取Wistar大鼠心房成纤维细胞,MTT试验检测心房成纤维细胞增殖情况。心房成纤维细胞分别予0、10、50和100ng/ml的PDGF-BB及50ng/ml PDGF-BB+AG1295(10μmol/1)培养 24 h,并予 50ng/ml 的 PDGF-BB 培养 24h、48h、72h 小时,RT-qPCR 和 Western-blot 分别检测各组细胞 COL1 mRNA和蛋白表达水平。结果1.miRNA-590-3p组Gluc/SEAP较miRNA阴性对照组下降20.96%(P<0.05),突变组与突变对照组Gluc/SEAP无名显差异(P>0.05)。2.MTT试验提示PDGF-B刺激大鼠心房成纤维细胞增殖。3.随着PDGF-BB浓度的增加,大鼠心房成纤维细胞COL1 mRNA和蛋白表达水平逐渐增加(P<0.01)。4.随着PDGF-BB培养时间延长,大鼠心房成纤维细胞COL1 mRNA和蛋白表达水平也渐增加(P<0.05)。5.AG1295可以减弱PDGF-BB促进心房成纤维细胞COL1合成的作用。结论双萤光素酶报告基因检测表明PDGFB是miRNA-590-3p直接调控的靶基因。miRNA-590-3p下调,对PDGF-B的抑制作用减弱,使得PDGF-B/PDGFR-β信号通路过度激活,刺激心房成纤维细胞分泌COL1等细胞外基质,促进心房纤维化,从而在房颤的发生中起着重要的作用。