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犊牛、羔羊大肠杆菌性腹泻是由产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC）引起的一种消化道传染病,临床多以急性剧烈腹泻、脱水等为主要特征。本病全年均可发生,2～3周龄的犊牛、6周龄内的羔羊易感染此病,死亡率较高,多呈地方性流行或散发,一旦爆发,将给牛羊养殖业带来巨大的损失。ETEC的特征是能够产生两种类型的毒力因子:与特定肠细胞受体结合后促进定植的黏附素和促进液体分泌的肠毒素。黏附作为ETEC感染细胞的基础,是决定疾病是否发生的前提。F17菌毛作为与犊牛羔羊腹泻高度相关的菌毛黏附素,主要由结构亚基F17-A和黏附亚基F17-G组成,其单克隆抗体（MAb）的制备、抗原表位的鉴定和检测方法的建立对深入研究携带该菌毛的ETEC的生物学特性、致病机制以及犊牛羔羊大肠杆菌性腹泻防治有重要的理论与实际意义。本研究开展了以下研究工作:（1）通过体外扩增F17-A、F17-G去信号肽后的基因片段,双酶切并连接到p ET-32a、p GEX-6p-1载体上,转化至感受态细胞并诱导其表达,获得了重组蛋白r F17-A-His（34ku）、r F17-G-His（53ku）、r F17-A-GST（43ku）和r F17-G-GST（62ku）。取携带His标签的重组蛋白作为免疫蛋白免疫Balb/c小鼠,取携带GST标签的重组蛋白作为检测蛋白检测免疫小鼠的血清效价。经细胞融合、筛选和亚克隆后得到了3株分泌抗F17-A的MAb的细胞:E9-A、A10-A、B11-A和3株分泌抗F17-G的MAb的细胞:F2-G、C3-G、E5-G。所获得的6株细胞均可稳定分泌MAb,且分泌的MAb类型为Ig G1,轻链为κ链。其中MAb A10-A、MAb F2-G效价最高,上清抗体效价可达到1:212和1:211、腹水效价可达到1:10~9和1:10~6。MAb A10-A、MAb F2-G不与F4、F5、F6、F41菌毛反应,具有较好的特异性。黏附抑制实验结果显示,MAb E5-G可以有效抑制ETEC（F17+）黏附肠上皮细胞。（2）通过截短表达法,多肽合成法和氨基酸突变法对MAb识别的抗原表位进行鉴定。F17-A表位鉴定结果显示,MAb E9-A识别的表位区域是41AKTAGLTPFT50,MAb A10-A识别的表位区域是151TVNYTIVYQ159,MAb B11-A识别的表位区域是81TGNLTNTASS90;F17-G表位鉴定结果显示,MAb F2-G识别的表位区域是~1AAVSFIGSTENDVGP15,MAb C3-G识别的表位区域是211GTTSLKLQCDAGVTV225,MAb E5-G识别的是位于凝集素结构域第89位的天冬氨酸（Asp）参与的构象表位,且该天冬氨酸是影响此构象表位与黏附受体结合的关键氨基酸。抗原表位保守性分析结果显示,MAb A10-A可以识别F17-A的所有变体,MAb E5-G可以识别F17-G的所有变体。（3）利用制备的MAb A10-A建立了细菌黏附细胞模型和间接免疫荧光检测方法。结果显示,Caco-2细胞比IPEC-J2细胞更有利于F17菌毛的黏附,且MOI=1:100、黏附1 h时黏附效果最佳。该模型为在细胞层面探究F17菌毛黏附机制提供研究基础。间接免疫荧光检测方法优化后的条件为4%多聚甲醛固定,1%BSA封闭,一抗MAb A10-A工作浓度为1:200,4℃过夜或37℃孵育1 h均可,二抗工作浓度为1:100,孵育时间为1 h。经检验只有F17菌毛产生特异性荧光,具有良好的特异性。初步应用该方法检测了3株携带F17菌毛的大肠杆菌,结果显示该方法可以检测不同菌株的黏附能力,差异明显直观,与荧光定量PCR（q PCR）检测结果相吻合,可用于实验室探究F17菌毛黏附机制的检测。（4）利用制备的MAb A10-A建立了以纳米微球为载体的间接凝集检测方法。优化后的微球致敏条件为直径410 nm微球20μL、0.06 M醋酸盐缓冲液500μL、纯化后的MAb A10-A 15μg、EDC 30μg,37℃致敏2 h后凝集效果最佳。该方法的特异性、敏感性、重复性和稳定性试验结果显示,只有携带F17菌毛的细菌发生凝集,最低可检出的细菌浓度为10~4CFU/m L,批间和批内检测结果一致,致敏微球4℃保存60 d内不影响检测结果,具有良好的特异性、敏感性、重复性和稳定性。初步应用该方法检测菌液样本,其检测结果与PCR检测结果的阳性符合率为100%,可用于临床检测F17菌毛。本研究通过分析F17菌毛结构特性,针对不同功能的亚基分别制备了单克隆抗体,并鉴定其所识别的抗原表位,为检测方法的建立提供了有效的生物制剂,也为F17菌毛黏附机制研究、新型药物和疫苗的研发提供了可靠的生物学信息。建立的细菌黏附间接免疫荧光检测方法和F17菌毛抗原间接凝集检测方法,为携带F17菌毛的ETEC病原学检测和流行病学调查提供了有效技术支持。