目的本研究探讨介导炎症反应的JAK2和介导免疫反应的CD95与结直肠癌预后的相关性；探讨JAK2和CD95受体在结直肠癌组织及细胞株中的表达水平，分析二者的相关性；通过抑制或增强JAK2的活化，探讨大肠癌细胞在增殖能力、细胞表型（上皮型/间质型）以及CD95活性方面的变化，从细胞和分子水平证实JAK2介导的炎症信号通路与大肠癌细胞的免疫功能之间的关系及其作用机制。方法1.利用生物信息学分析的方法：借助荷兰医学生物数据平台，分析来源于荷兰8家医院的大肠癌数据库中CD95和JAK2的表达水平、CD95和JAK2的表达与生存期的Kaplan-Meier曲线，借助平台中的基因热图（geneheatmap），将与CD95关系密切的基因呈现出来，以形象地呈现出CD95表达相关的功能基因；利用STRING在线软件分析预测CD95相关蛋白及其功能；利用基因文氏图（Gvenn）分析CD95相关基因与JAK2相关基因的重叠程度，并预测数据库中CD95与JAK2的相关性。利用在线meta软件计算3个数据库中CD95与JAK2总体相关性系数（r值、p值）。2.结直肠癌组织切片和细胞的获取：2011年10月-2012年5月在荷兰Utrecht大学医学中心胃肠外科经手术切除的结直肠癌组织，经福尔马林固定、石蜡包埋后制成结直肠癌组织切片，从中选取10例石蜡包埋组织切片；取同期手术切除的结直肠癌新鲜组织进行细胞建株并稳定传代获得结直肠癌（CRC）细胞，本实验选取其中9株用于研究。3. CD95和JAK2相关性分析：通过免疫组化染色检测CD95和JAK2在结直肠癌组织切片中的表达水平，通过免疫印迹法检测二者在CRC细胞中的表达水平，并分析二者的相关性。4.结直肠癌细胞中JAK2/STAT3的阻断：在细胞培养体系中加入JAK2特异性抑制剂AZD1480和CEP33779，通过western blot检测AZD1480和CEP33779在不同浓度（0.5μM~5μM）和不同作用时间（2h~24h）下JAK2、STAT3和pSTAT3水平，对照组为同一细胞株在相应浓度DMSO和作用时间下JAK2、STAT3和pSTAT3水平，阳性对照采用同一细胞株在IL-6（10ng/ml，30min）刺激后JAK2、STAT3和pSTAT3的水平。5.结直肠癌细胞的克隆形成能力检测：结直肠癌细胞团被解离成单个细胞后，以1000个细胞/100μl基质胶的浓度接种到12孔板中，待基质胶凝固后每孔添加2ml培养基，实验组及对照组试剂添加到培养基中。2天换1次液，12天后观察细胞团形成数量。6.流式细胞技术检测细胞凋亡：结直肠癌细胞分别经过一定浓度的JAK2特异性抑制剂AZD1480、CEP33779作用2天后，以等剂量的DMSO处理CRC细胞2天作为对照，采用荧光染料碘化吡啶（PI）染色（4℃）固定，4h后流式细胞仪检测细胞凋亡的百分率。7.免疫荧光和实时荧光定量PCR检测：JAK2特异性抑制剂CEP33779抑制JAK2/STAT3通路活化，对参与上皮-间质转化（EMT）的相关蛋白进行免疫荧光检测，对EMT标志物HIF-1、ZEB-1、ZEB-2、FABP、Snail-1、Snail-2、vimentin等转录因子的mRNA进行逆转录后荧光定量PCR检测。8. FasL刺激下细胞分泌细胞因子的检测：实验组培养体系FasL终浓度20ng/ml，对照组为同株无FasL的细胞，12h后收集上清液，经层析、浓缩后，通过细胞因子芯片检测结直肠癌细胞分泌细胞因子的变化。9. CD95-黄色荧光蛋白报告基因（YFP-CD95）的转染及CRC细胞的共聚焦显微镜检查：分别构建pWPT-CD95-YFP，同时构建pWPT-YFP作为对照。采用磷酸钙法转染，使用FuGene转染试剂将慢病毒包装载体和pWPT-CD95-YFP或pWPT-YFP转染进293T细胞。细胞培养24-48h后收集上清液获得病毒。CRC29和L145细胞培养6-16h后进行解离，用聚凝胺进行慢病毒上清转染24h。转染后的细胞根据YFP-CD95表达高低经流式细胞分选，从而获得纯度较高的CD95高表达细胞株。利用FasL和/或CEP33779作用CRC细胞1h、2h后，在共聚焦荧光显微镜下观察细胞表面YFP-CD95荧光信号的变化。结果1. CD95与JAK2在结直肠癌中的相关性（1）生物信息学分析CD95和JAK2与结直肠癌患者预后呈正相关CD95和JAK2在8个结直肠癌数据库共1293例结直肠癌病人组织中每组内部表达水平差异较大，而各数据库间无显著性差异；CD95和JAK2高表达，病人生存期较短。（2）CD95与JAK2在结直肠癌中的表达及功能相关性STRING分析显示CD95与结直肠癌的免疫反应、炎症反应与炎症因子关系密切。Gvenn分析显示CD95相关基因与JAK2高度相关。在线meta分析发现CD95相关基因中JAK2与其相关性最好。与CD95同时表达的基因，能够调控炎症反应、JAK2/STAT3信号通路、上皮-间质转化（EMT）。对10例结直肠癌石蜡切片的免疫组化检查发现CD95高表达的肿瘤组织同时存在JAK2高表达，反之亦然，二者呈正相关。（3）CD95和JAK2在结直肠癌细胞中表达的相关性经细胞建株并稳定传代的结直肠癌细胞株，包括来源于结直肠癌原发肿瘤的细胞株CRC26、CRC29、CR9、CR16、CRC48、CRC47，来源于肝转移灶的细胞株为L145、L167、L169。JAK2表达水平CRC29、CR9、CR16最高，其余依次为L169、CRC47、CRC48、L167、L145、CRC26，CD95表达水平由高到低依次为CRC29、L145、CRC47、CR16、CRC48、CRC26、L169、CR9、L167。9株CRC细胞株中CD95与JAK2的表达具有一定的相关性（r2=0.5087，p=0.0470），而来源结直肠的原发肿瘤细胞CD95与JAK2的表达相关性较好（r2=0.7360，p=0.0289）。2. JAK2对结直肠癌细胞增殖、凋亡、EMT的影响（1）JAK2活化抑制后结直肠癌细胞的克隆增殖能力变化结直肠癌细胞在基质胶中培养，对照组用等浓度的DMSO处理，实验组利用JAK2抑制剂阻断JAK2活化，其克隆增殖能力明显降低。（2）JAK2活化后结直肠癌细胞的克隆增殖能力变化结直肠癌细胞在基质胶中培养，实验组利用合适浓度的IL-6活化JAK2，其克隆增殖能力较对照组明显增强。不同IL-6浓度刺激下结直肠癌细胞的克隆增殖无明显差异。（3）JAK2阻断后CRC细胞凋亡率变化对于悬浮培养的结直肠癌细胞CRC29，用不同作用浓度的JAK2特异性抑制剂AZD1480和CEP33779分别阻断JAK2活化，抑制剂作用2天后，采用碘化吡啶（Propidium Iodide，PI）染色法检测CRC细胞凋亡。与对照组相比，JAK2特异性抑制后CRC细胞凋亡无明显增加（p>0.05）。（4）JAK2阻断下FasL诱导细胞凋亡率变化对于悬浮培养的结直肠癌细胞CRC29，JAK2特异性抑制AZD1480和CEP33779阻断JAK2活化，2h后在培养体系中加入杀伤剂量（20ng/ml）的FasL，作用2天后检测CRC细胞凋亡。AZD1480和CEP33779两组中CRC29细胞凋亡率分别为33.52%、38.76%，AZD1480预先抑制JAK2活化后FasL诱导CRC29细胞凋亡增至41.20%、45.19%，CEP33779预先抑制JAK2活化后FasL诱导CRC29细胞凋亡增至62.34%、62.65%。（5）JAK2抑制后与EMT相关的蛋白表达及转录因子水平发生变化①CRC29细胞系在悬浮培养条件下，与IL-6刺激的CRC29细胞系相比，受到JAK2抑制的CRC29细胞系Caveolin-1表达减低，E-cadherin表达升高，共聚焦显微镜下可见到实验组细胞－细胞连接处Caveolin-1荧光信号减弱，E-cadherin荧光信号明显增强。②CRC29细胞系在悬浮培养条件下，与IL-6刺激的CRC29细胞系相比，受到JAK2抑制的CRC29细胞系HIF-1、ZEB-1、FABP、Snail-1、等基因mRNA表达降低，其中ZEB-2、Snail-2和HIF-2变化最为明显，vimentin表达增加。3.特异性阻断JAK2对CRC细胞CD95表型的影响（1）FasL能够刺激CRC细胞分泌细胞因子变化FasL作用24h后CRC细胞分泌IL-8、IL-15R alpha水平升高，而预先加入CEP33779抑制JAK2活化的CRC细胞分泌IL-8水平进一步升高。（2）转染CD95-YFP细胞株对FasL及JAK2阻断的反应对成功转染了CD95-YFP质粒并稳定表达CD95-YFP的结直肠癌细胞系CRC29，分别用FasL、CEP33779、CEP33779预处理1h而后FasL（CEP33779→FasL），作用1h后，给予固定，随后通过荧光显微镜观察细胞膜上带有黄色荧光信号的CD95的表型变化，即是否聚集成为活性形式，对照组以等浓度的DMSO作用于培养体系，结果发现在JAK2阻断1h后，细胞膜表面荧光强度明显高于对照组，而CEP33779→FasL处理组CRC细胞表面CD95表达明显耗减。结论1.对多个结直肠癌数据库的生存曲线荟萃分析得知，结直肠癌组织中CD95和JAK2高表达，患者的生存期较短。2.结直肠癌数据库中CD95与JAK2在表达、功能相关通路等方面的相关性分析表明，CD95与JAK2在结直肠癌组织中的高度相关性，主要体现在肿瘤的免疫反应、炎症反应、JAK2/STAT3信号通路、上皮-间质转化（EMT）几个方面。3.体外培养的结直肠癌细胞在增殖过程中，JAK2/STAT3处于较低水平的活化状态，特异性阻断JAK2/STAT3通路能够降低或完全抑制肿瘤细胞的克隆形成能力，提示JAK2在肿瘤细胞增殖方面具有关键作用；特异性阻断JAK2/STAT3通路在一定程度上抑制了肿瘤EMT，从而对肿瘤细胞的迁移可能产生一定的抑制作用；而JAK2/STAT3的过度活化则促进肿瘤细胞增殖。JAK2抑制不能诱导CRC细胞凋亡，而FasL可诱导肿瘤细胞凋亡增多。4.通过转染CD95-YFP报告基因并使其稳定表达CD95的结直肠癌细胞系CRC29（CRC29CD95-YFP），抑制JAK2/STAT3通路有助于肿瘤细胞表面CD95单体寡聚化形成转变成活性形式，为介导细胞凋亡提供细胞表面结构条件，从而证明JAK2对CRC细胞膜上CD95具有一定的稳定作用。