背景：Aiolos是锌指蛋白Ikaros家族成员之一,主要在淋巴细胞表达,通过基因转录调控促进淋巴细胞的后期发育和功能特化。有研究发现Aiolos表达异常(增多或减少)均会导致造血系统恶性肿瘤,2012年在乳腺癌病人肿瘤细胞转录谱中检测到了Aiolos的表达,说明Aiolos的表达并不仅限于淋巴细胞,但是Aiolos在实体肿瘤细胞中的异位表达对肿瘤细胞产生何种影响,对肿瘤的发生发展起何种作用并不清楚。目的：阐明Aiolos在肺癌细胞中异位表达产生的细胞学效应及机制；明确Aiolos与肺癌转移的相关性,判断它是否可以作为肺癌病人预后的分子标记或者临床治疗的分子靶点；探讨Aiolos在肺癌细胞中异位表达的表观遗传机制。通过这些研究,期望能够丰富人们对于肺癌发生以及转移调控网络的认识,为临床肺癌的诊疗提供资料。方法：1.利用免疫组织化学方法和单细胞RT-PCR结合毛细管电泳技术检测临床肺癌组织包括非小细胞肺癌组织及相应癌旁组织、小细胞肺癌组织中Aiolos的表达情况,确定Aiolos表达水平与肿瘤分期、预后等的相关性。2.利用芯片技术,通过比较A549过表达Aiolos前后转录图谱的变化,确定Aiolos异位表达能够影响哪些基因的表达,初步判断Aiolos异位表达所产生的细胞生物学效应,并进行细胞成瘤实验、迁移实验、侵润实验以及MCF-10A三维培养实验进行验证。3.过表达Aiolos的A549细胞通过鼠尾静脉注射入BALB/C裸鼠体内,确定Aiolos对肿瘤细胞远端转移的影响。4.利用3C、CHIP、Luciferase Assay等分子生物学技术研究Aiolos调控基因表达的分子机制。结果：1.淋巴细胞特异性转录因子Aiolos在肺癌中异位表达且其表达水平与病人存活时间负相关Aiolos在正常肺组织中不表达,在非小细胞肺癌组织中表达,尤其在小细胞肺癌中呈现高表达并且定位于细胞核中。对59例三期肺癌组织免疫组化检测结果进行生存分析发现Aiolos在肺癌中的表达水平与患者的预后呈显著负相关(p<0.001)。2. Aiolos表达诱发肿瘤细胞EMT,促进肿瘤细胞在小鼠体内远端转移(1) Aiolos过表达后A549细胞表现出Mesenchymal特性,细胞呈梭形,细胞间连接消失,RT-PCR检测发现E-cadherin转录下调,Snaill、ZEB1上调；FACS检测细胞发生G1期阻滞。(2)芯片结果显示Aiolos异位表达主要引起细胞粘附相关基因表达的变化,大量’Focal Adhesion"蛋白、细胞-基质连接蛋白等转录下调,其中包括定位于focal adhesiob、通过感受细胞张力变化而启动细胞失巢凋亡的衔接蛋白p66Shc,我们前期工作显示P66Shc在上皮细胞来源的实体肿瘤细胞表达缺失是导致肿瘤细胞逃脱失巢凋亡发生转移的主要因素(Oncogene,2010)。(3)利用芯片技术检测207例肺表皮细胞系其中包括59例正常肺表皮细胞、148例肺癌细胞的p66Shc转录本,发现与Aiolos表达特性相反,正常肺表皮细胞中P66Shc表达,而肺癌细胞系中P66Shc表达下调,尤其在小细胞肺癌细胞中下调程度更大；对Aiolos和P66Shc的免疫组化结果发现肺癌组织中二者的表达呈负相关；分离新鲜肿瘤组织单个肿瘤细胞,利用RT-PCR结合毛细管电泳检测Aiolos和p66Shc的表达情况,我们分离了4个肿瘤组织共201个肿瘤细胞,其中77%的细胞中只表达Aiolos,不表达p66Shc,7.5%的细胞中只表达P66Shc,不表达Aiolos,12.5%的细胞中二者同时表达,3%的细胞中二者都不表达,进一步证实肺癌细胞中Aiolos与p66shc的负相关性；当在表达p66Shc而不表达Aiolos的肿瘤细胞中过表达Aiolos, p66Shc被抑制；这些实验结果说明Aiolos能够下调失巢凋亡关键蛋白p66Shc的表达。(4)过表达Aiolos的细胞较对照组细胞在低吸附培养皿中具有更高的存活能力,在Soft Agar中具有更高的成瘤能力；正常的MCF-10A细胞在Matrigel三维培养中由于内部细胞失去与基质的贴附发生失巢凋亡而形成一个中空的乳腺腔,在过表达Aiolos后细胞失去极性并且内部细胞逃逸失巢凋亡形成一个实体球形结构,这些实验说明Aiolos在实体肿瘤细胞的异位表达能够促进肿瘤细胞逃逸失巢凋亡。当在这些过表达Aiolos的细胞中同时过表达p66Shc, Aiolos的促进细胞失巢凋亡抵抗功能被抑制,细胞恢复到失巢凋亡敏感状态,提示Aiolos对失巢凋亡的抑制是通过下调p66Shc的表达。(5)过表达Aiolos的A549细胞通过鼠尾静脉注射入BALB/C裸鼠体内,注射10周后Aiolos过表达组6只小鼠全部死于肺转移癌,而6只对照组小鼠只有1只死亡,二者差异显著,说明Aiolos促进肿瘤细胞远端转移。3. Aiolos直接结合p66Shc上游调控序列,破坏p66shc基因的染色质高级结构,抑制p66Shc基因转录(1)利用DNA序列同源性比较,ChIP检测H3K27乙酰化、H3K4单甲基化等组蛋白的分布,我们在p66Shc基因上游发现了三个潜在的顺式调控元件(E1、E2、E3),经Lucifrase Assay和3C实验证实E2是p66Shc表达必需的增强子,E2与p66shc启动子直接相互作用促进p66Shc基因转录,这种相互作用使得p66Shc基因在活跃表达时呈现环状结构,在小细胞肺癌细胞中,环状染色质高级结构消失。(2)经ChIP发现Aiolos结合于P66Shc启动子以及上游区域,Luciferase Assay实验证实Aiolos能够抑制E2的功能,3C检测Aiolos过表达A549细胞中p66shc基因E2-p66Shc启动子相互作用消失,说明Aiolos通过破坏E2与启动子间相互作用直接抑制p66Shc基因转录。结论：Aiolos在肺癌细胞中异位表达,降低细胞-细胞间连接,降低细胞-基质间粘附,并通过破坏p66Shc基因染色质高级结构而下调p66Shc基因的转录进而促进肿瘤细胞逃逸失巢凋亡,最终促进肺癌细胞远端转移。由于生理状态下Aiolos仅表达于淋巴细胞,而转移的实体肿瘤细胞在细胞粘附、失巢凋亡特性上与淋巴细胞相似,由此我们认为实体肿瘤细胞在转移过程中通过获得造血细胞特异性转录因子而使得实体肿瘤细胞能够游离原有生长环境并具有了失巢凋亡抵抗能力。我们的研究结果丰富了人们对于实体肿瘤转移调控网络的认识,证实了失巢凋亡抵抗在肿瘤细胞转移中的重要性,为针对肿瘤转移进行临床肿瘤治疗提供新的思路。