该课题立足于神经元凋亡新的调控分子和调控机理的研究,以该实验室首次发现的苯妥英诱导的小脑颗粒神元凋亡的现象为基础,系统研究苯妥英诱导的小脑颗粒神元凋亡的特性,确证苯妥英诱导的小脑颗粒神经元凋亡作为神经元凋亡模型的可行性和优越性,探索了其可能的胞内信号转导机制,并结合复极化诱导的小脑颗粒神经元凋亡的模型,对该实验室前期采用DD-PCR所获得的差异EST片段进行筛选,选取其中一个差异片段,RACE法获取该基因的全长cDNA序列(命名为YZ-1基因),最后采用RT-PCR及荧光定量PCR结合生物信息学方法初步探讨了该基因的功能.该文分四章:第1章:苯妥英诱导的小脑颗粒神经元凋亡;该章对苯妥英(DPH)诱导体外培养的小脑颗粒神经元凋亡的药理学特性进行了系统的研究,考查其作为神经元凋亡模型的可行性及特性;并观察不同作用机理的凋亡抑制剂对苯妥英诱导的小脑颗粒神经元凋亡的影响,为探索其可能的凋亡分子机制和DPH临床应用的神经毒性机制提供参考.结论:苯妥英诱导的小脑颗粒神经元凋亡过程具有明显的时效和量效关系,是一个典型的、重复性好的神经元凋亡模型.深入研究其分子机制有助于阐明苯妥英等药物的毒性作用机理.第2章:苯妥英诱导的小脑颗粒神经元的凋亡的信号转导机制;该章从信号转导的角度探索了PI3K/Akt通路及MAPK家族成员在苯妥英诱导的小脑颗粒神经元凋亡中的作用,以进一步从分子水平深入了解苯妥英诱导的小脑颗粒神经元凋亡的特性. 结论:Akt、ERK参与了苯妥英诱导的小脑颗粒神经元的凋亡,c-Jun是苯妥英诱导的小脑颗粒神经元凋亡的重要调节因子,在此过程中被未明机制激活. 第3章:凋亡调控基因YZ-1的克隆;该章选取4条EST片段,首先采用RT-PCR在苯妥英诱导的小脑颗粒神经元凋亡的模型及复极化凋亡模型中进行差异表达的验证,采用RACE法对确证为差异表达的片段进行全长cDNA克隆,为进一步研究其在神经元凋亡/存活调控中的作用奠定基础,以期发现神经元凋亡/存活新的调控分子或新的调控机制.结论:YZ-1基因直接来源于小脑颗粒神经元,其在差异克隆过程中,经过三次(DD-PCR,反Northern,RT-PCR)验证为阳性差异片段,并被证明在两种神经元凋亡模型(苯妥英凋亡模型和复极化凋亡模型)中被上调,因此,YZ-1基因极有可能是调控小脑颗粒神经元凋亡/存活的功能基因,有进一步研究的价值.YZ-1全长cDNA序列的克隆为其功能的研究奠定基础.第4章:YZ-1基因功能的初步研究;生物信息学的飞速发展为基因的结构和功能的预测提供了有力工具,人们可以通过生物信息学的方法快速地揭示大量核酸或蛋白序列数据中所蕴含的生物信息,从而预测目的基因或目标蛋白可能的结构和功能.参考生物信息学预测的结果,采用RT-PCR和荧光定量PCR研究了各种处理因素对YZ-1基因表达量的影响,以深入了解YZ-1基因在神经元凋亡/存活中的作用.结论:YZ-1基因可能在凋亡早期被应激上调,在凋亡末期被明显抑制,其可能不是介导凋亡的基因,而极有可能与神经元自身防御机制或神经元的应激反应有关.