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喹乙醇(Olaquindox, OLA)系一种邻硝基苯胺类抑菌促生长剂,广泛用于动物疾病治疗和畜牧业生产。随着集约化养殖业的发展,兽药可以通过原型、代谢产物的形式借助于环境转归和食物链传递等途径最终到达人体,损害人类健康。毒理学研究表明：喹乙醇具有遗传毒性、生殖毒性、蓄积毒性和对肝、肾的靶器官毒性,欧盟已认定喹乙醇为致突变物和可疑致癌物。毒代动力学资料显示,喹乙醇主要代谢途径是经肾脏排出,动物实验也显示其对肾脏的实质性损伤。人源肾小管上皮细胞(Human Kidneys, HK-2)来源于正常人肾小管近端上皮组织,保留了肾小管上皮细胞的多种酶学、电生理学和表型特征,是研究肾脏毒性作用机制的典型细胞系。本研究以喹乙醇代谢产生活性氧为切入点,运用体外细胞培养的方法构建HK-2细胞损伤模型,通过检测内质网应激及凋亡标志蛋白的变化,初步探讨喹乙醇对HK-2细胞毒效应的作用机制,从体外角度为喹乙醇所致肾损伤的可能效应路径提供技术依据。1.喹乙醇染毒浓度和时间对HK-2细胞凋亡的影响1)喹乙醇对HK-2细胞有增殖抑制效应,24h ⅠCso值为6.8μmol/ml,R=0.9721;2)与DMSO对照组比较,喹乙醇染毒1μmol/ml组细胞早期凋亡率无明显变化(p>0.05),喹乙醇染毒(2、3和4μmol/ml)组细胞早期凋亡率升高(p<0.05),两两比较显示：染毒2μmol/ml组和3μmol/ml组、3μmol/ml组和4μmol/ml组,组间细胞早期凋亡率有差异(p<0.05),喹乙醇可呈剂量依赖性的诱发HK-2细胞凋亡；3)与染毒0h的对照组比较,喹乙醇(3μmol/ml)染毒6h组细胞早期凋亡率无明显变化(p>0.05),染毒(12和24h)组细胞早期凋亡率升高(p<0.05),两两比较显示：染毒6h组和12h组、12h组和24h组,组间细胞早期凋亡率有差异(p<0.05),喹乙醇可呈时间依赖性的诱发HK-2细胞凋亡。2.喹乙醇染毒浓度和时间对HK-2细胞内ROS含量的影响1)与DMSO对照组比较,喹乙醇染毒(1、2、3和4μmol/ml)组细胞内ROS含量均升高(p<0.05),两两比较显示：染毒1μmol/ml组和2μmol/ml组、2μmol/ml组和3μmol/ml组、3μmol/ml组和4μmol/ml组,组间细胞ROS含量有差异(p<0.05),喹乙醇可呈剂量依赖性的诱发HK-2细胞内ROS含量增加；2)与染毒Oh对照组比较,喹乙醇(3μmol/ml)染毒(6、12和24h)组细胞内ROS含量升高(p<0.05),两两比较显示：染毒6h组和12h组、12h组和24h组,组间细胞ROS含量有差异(p<0.05),喹乙醇可呈时间依赖性的诱发HK-2细胞内ROS含量增加。3.喹乙醇对HK-2细胞中内质网应激及凋亡蛋白表达的影响1)与DMSO对照组比较,喹乙醇染毒1μmol/ml组GRP94、GRP78、CHOP和Caspase-4蛋白表达无明显变化(p>0.05),喹乙醇染毒(2、3和4μmol/ml)组GRP94、GRP78、CHOP和Caspase-4蛋白表达升高(p<0.05)；2)与染毒0h对照组比较：喹乙醇(3μmol/ml)染毒6h组GRP94、GRP78和Caspase-4的蛋白表达量无明显变化(p>0.05),染毒(12和24h)组GRP94、 GRP78和Caspase-4的蛋白表达量升高(p<0.05),染毒(6、12和24h)组CHOP的蛋白表达量升高(p<0.05)：3)喹乙醇可诱导HK-2细胞中内质网应激及凋亡标志性蛋白表达增加。4.喹乙醇对HK-2细胞中内质网应激及凋亡蛋白转录水平的影响1)与DMSO对照组比较,喹乙醇染毒1和2μmol/ml组GRP94和GRP78的mRNA水平无明显变化(p>0.05),喹乙醇染毒(3和4μmol/ml)组GRP78和GRP94的mRNA水平上调(p<0.05),喹乙醇染毒1μmol/ml组Caspase-4的mRNA水平无明显变化(p<0.05),喹乙醇染毒(2、3和4μmol/ml)组Caspase-4的mRNA水平上调(p<0.05)；2)与染毒0h对照组,喹乙醇(3μmol/ml)染毒6h组GRP78和Caspase-4mRNA水平无明显变化(p>0.05),染毒(12和24h)组GRP78和Caspase-4mRNA水平上调(p<0.05),染毒(6、12和24h)组GRP94mRNA水平上调(p<0.05)；3)喹乙醇可诱导HK-2细胞中内质网应激和凋亡标志性蛋白转录水平上调；4)内质网应激及凋亡相关蛋白GRP78、GRP94、Caspase-4蛋白表达变化与mRNA水平变化趋势相似。5.ROS抑制剂在喹乙醇(3μmol/ml)致HK-2细胞凋亡中的作用1)NAC预处理组与对照组比较：细胞内ROS含量、细胞早期凋亡率显著均减少(p<0.05), GRP94、GRP78、Caspase-4和CHOP蛋白表达量均减少(p<0.05)；2)喹乙醇诱导的HK-2细胞凋亡与细胞内ROS增加有关,ROS可能是内质网应激及其凋亡的关键因素。