天然存在的托品烷类生物碱包括樟柳碱(anisodine)、莨菪碱(hyoscyamine)、山莨菪碱(6β-hydroxyhyoscyamine)、东莨菪碱(scopolamine)等。这类生物碱被广泛用于抗胆碱药,能与乙酰胆碱竞争性结合毒蕈碱受体,能阻断特定的神经脉冲,达到镇定效果,这类药主要作用于副交感神经进行治疗。三分三(Anisodus acutangulus)是我国云南特有的茄科多年生的药用植物,由于它可以产生较高含量的托品烷生物碱而被重视。植物代谢过程中,在莨菪碱6β-羟化酶(H6H)的作用下,经过一步羟化反应和一步环氧化反应,莨菪碱可以转化形成东莨菪碱,但在绝大多数茄科类植物中后者的量要远低于前者。而东莨菪碱因其具有药理活性高、对人体副作用小等特点,为此,在原有巨大市场基础上,东莨菪碱的需求还在迅速增长。近年来,通过基因工程手段,建立了毛状根中次生代谢产物的迅速积累培养体系,获得了一些珍贵的天然次生代谢产物,取得了令人鼓舞的研究结果,但是用基因突变改造结合转基因技术来提高次级代谢产物的研究较少。本课题在前期与华东理工大学合作筛选得到的,可在体外提高AaH6H羟化活力(突变位点Ser14Pro和Lys97Ala)的分子改造基因mAaH6H的基础上,进一步将其遗传导入三分三毛状根中,考察其对东莨菪碱的代谢合成与生物转化的影响。以分子改造过的mAaH6H基因为模板,克隆出该分子改造过的基因,构建含分子改造过的mAaH6H基因的植物过表达载体,并以未改造的三分三关键酶基因AaH6H构建植物过表达载体作对照;通过发根农杆菌介导,对三分三外植体进行遗传转化,从而获得分子改造过的mAaH6H基因和未改造过的AaH6H基因过表达的三分三转基因毛状根株系;经PCR初步检测,确定目的基因已经插入到转基因毛状根基因组中后,通过定量RT-PCR的方法分析目的基因在转基因毛状根中的表达情况,然后采用高效液相色谱法(HPLC)测定转基因毛状根中托品烷生物碱(莨菪碱,山莨菪碱和东莨菪碱)的含量;分析其在三分三毛状根中对东莨菪碱生物合成及转化过程的影响。目前取得的结果如下:1.通过NCBI上的BLAST工具,分析找出11种不同物种的H6H同源基因,对其与AaH6H等进行系统进化树,结果表明:AaH6H与颠茄(Atropa belladonna)AbH6H的相似度最高,达到92%,其次是与(Brugmansia arborea)木本曼陀罗BaH6H的相似度达到91%。多重序列比对结果表明,三分三AaH6H和产托品烷生物碱物种的H6H有很高的同源性。2.将所获得的带有pMON530-AaH6H-GFP和pMON530-GFP载体的ASE农杆菌在烟草中瞬时表达。用扫描激光共聚焦显微镜进行观察,同时设立空载体对照。初步结果表明AaH6H羟化酶在细胞膜上表达。3.将AaH6H的氨基酸序列输入PDB蛋白结构数据库进行pBLAST比对,比对结果发现同源性最高的蛋白是来源于拟南芥中的花青素合酶,以该蛋白的晶体结构为模板,利用Swiss-model同源建模,分析其氨基酸突变位点,发现两个突变热点氨基酸Ser14和Lys97都位于蛋白结构的表面。4.组织表达谱分析结果表明,AaH6H为组成型表达基因,在不同组织中的表达各异,AaH6H在根中表达量最高,其次为叶,这些结果表明AaH6H主要在根中发挥功能,而大部分生物碱存在于根中。5.HPLC分析结果表明,经分子改造的mAaH6H过表达毛状根中的总生物碱含量,比AaH6H过表达毛状根中的总生物碱含量有明显的提高,其中莨菪碱、东莨菪碱的含量相比AaH6H过表达毛状根中的含量有不同程度的升高,而大部分山莨菪碱的含量相比AaH6H过表达毛状根有轻微的下降。经分子改造的mAaH6H过表达毛状根中总托品烷类生物碱含量,比AaH6H过表达毛状根中的含量有明显的提高,可能是因为分子改造的mAaH6H参与了生物碱的调控,并且分子改造后的关键酶的活性被提高了,从而促进生物碱的合成,特别是大幅度的提高了山莨菪碱向东莨菪碱的转化,对上调三分三毛状根东莨菪碱的含量发挥着显著的作用。