论文部分内容阅读
第一部分乏氧对乳腺癌细胞增殖的影响目的:观察乏氧对乳腺癌细胞增殖的影响。确定最佳乏氧时间。初步研究乏氧与Notch通路间的关系。方法:取指数生长期的乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7细胞消化计数后按4×103个/孔接种于96孔细胞培养板中,过夜培养贴壁后,放入乏氧箱内（37℃,1%O2,5%CO2,94%N2）,分别培养2、4、6、8、10、12、24、48小时后用MTT法检测乏氧对乳腺癌细胞增殖的影响;确定增殖表达最明显的时间点。取指数生长期细胞消化计数后按1.2×105个/孔接种于6孔细胞培养板中,过夜培养贴壁后,放入乏氧箱内（37℃,1%O2,5%CO2,94%N2）4h后,流式细胞仪测定细胞周期,Real-time PCR分析Notch及相关基因hes1、hey1、cyclinD、CDK2、p21的mRNA表达量的变化。结果:乏氧能明显促进乳腺癌细胞的增殖,其增殖表达最明显的时间是乏氧环境下培养4小时。乏氧促细胞增殖,G0/G1期细胞比例明显减少（P＜0.05）,CyclinD、CDK2的mRNA表达水平显著上升（P＜0.05）,而p21的mRNA表达水平显著降低（P＜0.05）;乏氧环境下,乳腺癌细胞Notch1及其下游基因Hey1、Hes1的mRNA表达水平均显著升高（P均＜0.05）;结论:乏氧促进乳腺癌细胞的增殖,很可能是通过Notch信号传导通路来实现的。第二部分siRNA下调Notch1基因表达后乏氧对乳腺癌细胞增殖的影响目的:应用小RNA干扰技术下调Notch1基因表达后,观察乏氧对乳腺癌细胞增殖的影响,探讨乏氧与Notch信号通路之间的关系。方法:取指数生长期细胞消化计数后按4×103个/孔接种于96孔细胞培养板中,24小时后应用Lipofectamine2000将针对Notch1的siRNA片段转染乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF7。在干扰72h后,放入乏氧箱（37℃,1%O2,5%CO2,94%N2）孵育4小时,用MTT法检测乏氧对乳腺癌细胞增殖的影响。同样取指数生长期细胞消化计数后按1.2×105个/孔接种于6孔细胞培养板中,24小时后应用同样方法转染乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF7。在干扰72h后,放入乏氧箱（37℃,1%O2,5%CO2,94%N2）孵育4小时,Real-time PCR分析Notch及相关基因hes1、hey1、cyclinD、CDK2、p21的mRNA表达量的变化。流式细胞仪测定细胞周期,Westen blot检测相关蛋白的表达改变。结果:针对Notch1基因设计的siRNA转染乳腺癌细胞系MDA-MB-231和MCF-7,可有效封闭Notch1基因表达,明显抑制乏氧对乳腺癌细胞的增殖,呈G1期阻滞,相关下游基因hes1、hey1的mRNA表达水平明显下降,周期相关蛋白CyclinD、CDK2的mRNA含量及蛋白表达水平明显降低,而p21基因的mRNA含量及蛋白表达水平则均升高（P均＜0.05）。结论:靶向Notch1的RNA干扰技术可有效抑制乏氧对乳腺癌细胞的促增殖作用。因此Notch1是治疗乳腺癌的有效分子靶点,有望成为乳腺癌生物治疗的新途径,并且可以和传统的化疗药物联合应用,以降低化疗药物毒副作用,增强其抗肿瘤治疗效果。