论文部分内容阅读
伪狂犬病毒（Pseudorabies virus,PRV）是严重危害养猪业的传染性病原体,g B和g D糖蛋白是PRV重要的免疫原性蛋白,PRV的g B和g D蛋白的编码基因是开发PRV的重组载体疫苗的目标基因。本文利用重组腺相关病毒（Recombinant adeno-associated virus,r AAV）表达系统,以PRV临床变异毒株PRV/JXFC/2015株基因组为样本,通过PCR技术构建表达PRV的g B和g D糖蛋白的重组AAV2/9型腺相关病毒,并研究了该活病毒载体的生物学特性以及其对小鼠的免疫原性,该工作为开发新的PRV疫苗奠定了宝贵的基础。主要内容如下:1.表达PRV的g B和g D糖蛋白的腺相关病毒的构建本研究以PRV临床变异毒株PRV/JXFC/2015株基因组为样本,进行g D和g B蛋白的编码基因的PCR扩增,将g D和g B基因片段分别酶切替换连接到p AAV核心质粒上,为了便于验证表达系统的功能,我们构建得到用于包装r AAV的核心质粒是分别携带红色荧光蛋白（Mcherry）和绿色荧光蛋白（EGFP）报告基因的核心质粒p AAV-PRV-g D-P2A-Mcherry、p AAV-PRV-g B-P2A-EGFP。上述质粒经过酶切与测序验证正确。2.表达PRV的g B和g D糖蛋白的腺相关病毒的制备采用三质粒转染HEK-293T细胞制备r AAV的方法,成功制备出了表达PRV的g B和g D糖蛋白的重组AAV2/9型腺相关病毒,批号分别为r AAV2/9-PRV-g B-P2A-EGFP-Z20200103和r AAV2/9-PRV-g D-P2A-Mcherry-Z20200103,滴度分别是2.5×1012vg/m L和5.00×1012vg/m L。3.表达PRV的g B和g D糖蛋白的腺相关病毒对C57小鼠的免疫试验将r AAV2/9-PRV-g B-P2A-EGFP、r AAV2/9-PRV-g D-P2A-Mcherry通过小鼠右后肢胫前肌内注射进行免疫,试验组的每组免疫5只C57小鼠,每只的免疫剂量为5×1012vg/kg,试验组分别是:第一组（r AAV-PRV-g B-P2A-EGFP）、第二组（r AAV2/9-PRV-g D-P2A-Mcherry）、第三组（r AAV2/9-PRV-g B-P2A-EGFP和r AAV2/9-PRV-g D-P2A-Mcherry相同剂量混合）;商品疫苗阳性对照组,免疫5只小鼠,每只的免疫剂量为10μL/g;PBS阴性对照组,免疫5只小鼠。免疫后第2,12,16,20,24,28周采血,用野毒PRV/JXFC/2015毒株检测血清中和抗体水平。并对免疫后第28周采血收集的血清样本,进行PRV/JXFC/2015野毒株和CH-18野毒株交叉中和试验。小鼠血清中和抗体实验的结果表明:针对PRV/JXFC/2015野毒株的病毒血清中和抗体检测,阴性对照PBS组以及r AAV2/9-PRV-g B-P2A-EGFP组的所有时间点的5只小鼠的混合血清的中和抗体水平为0,其中r AAV2/9-PRV-g B-P2A-EGFP和r AAV2/9-PRV-g D-P2A-Mcherry相同剂量混合注射组的混合血清的中和抗体水平分别是1:8、1:19.95、1:22.9、1:5.6、1:5.01、1:31.6;阳性对照商品疫苗组的混合血清的中和抗体水平分别是1:16、1:16、1:16、1:16、1:16、1:22.38;r AAV2/9-PRV-g D-P2A-Mcherry组的混合血清的中和抗体水平分别是1:5、1:64、1:32、1:44、1:39.8、1:56.2。对28周的混合血清做的针对CH-18野毒株的交叉中和检测,r AAV2/9-PRV-g B-P2A-EGFP组混合血清中和抗体水平为0,r AAV2/9-PRV-g D-P2A-Mcherry组混合血清中和抗体水平≥1:256,r AAV2/9-PRV-g B-P2A-EGFP和r AAV2/9-PRV-g D-P2A-Mcherry组的混合血清的中和抗体水平为1:89.125,阳性对照商品疫苗组混合血清的中和抗体水平为1:42,阴性对照PBS组的混合血清的中和抗体水平为0。进一步的测定各组在各个时间点的5只小鼠的混合血清中的IFN-γ、IL-4细胞因子含量,结果显示,r AAV2/9-PRV-g D-P2A-Mcherry组最高为1973.65 pg/m L的IFN-γ水平和161.01 pg/m L的IL-4水平,商品疫苗IFN-γ水平最高为1959 pg/m L,IL-4水平最高为103.89 pg/m L。细胞因子测定实验结果表明r AAV2/9-PRV-g D-P2A-Mcherry组产生出了比商品疫苗组更高的免疫细胞因子表达水平。总之,r AAV2/9-PRV-g D-P2A-Mcherry组在试验中效果显著,通过单针免疫小鼠后,在小鼠体内激发了非常明显并且持久的体液免疫与细胞免疫应答,达到较长的免疫效力保护周期和更高的持续保护效力。