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川丁特罗(2-(4-氨基-3-氯-5-三氟甲基苯基)-2-叔丁氨基乙醇,trantinterol),是沈阳药科大学程卯生教授采用Me-too策略,独立研发具有自主自主知识产权的一种新型β2受体激动剂。药理实验表明,川丁特罗通过选择性激动气道平滑肌上的β2受体,使平滑肌松弛而发挥其抗哮喘的作用,有效性和安全性良好。本试验首次建立了LC/MS/MS法用于测定生物样品中川丁特罗的浓度,对川丁特罗进行临床药代动力学研究,这为本品临床的安全、合理用药奠定了基础。同时,本试验建立了体外MDCK-MDR1和Caco-2细胞模型,并探索了川丁特罗在人体内的转运和吸收机制。一、川丁特罗人体药代动力学的研究首次建立了一种LC/MS/MS分析方法,用于测定人血浆中川丁特罗的浓度。采用Venusil MP C18色谱柱(50×4.6 mm, I.D., 5μm),以甲醇:水(含1%甲酸)(50:50,v/v)为流动相,流速为0.8 mL/min,LC/MS/MS配有电喷雾离子化源,采用正离子化方式,在选择反应监测(MRM)模式下,选择m/z 311.2→m/z 238.1和m/z 277.2→m/z 203.1为待测物川丁特罗和内标克伦特罗的定量离子对。方法确证表明,该方法的精密度和准确度、稳定性、提取回收率和基质效应等均符合SFDA规定和要求。应用该方法对人口服给予川丁特罗25μg、50μg和100μg后的吸收情况进行系统研究。结果表明:3个剂量组的血浆中Cmax分别为12.2±4.2 pg/mL,20.0±4.3 pg/mL和48.6±14.3 pg/mL;AUC0-t分别为87.0±40.7 pg?h/mL、125.1±48.3 pg?h/mL和222.9±64.8 pg?h/mL。采用SPSS 14.0软件,对参数进行相关性分析,人体内的低、中、高三个剂量下的主要药动学参数AUC0-t及Cmax均与给药剂量呈线性相关。表明在25～100μg内,川丁特罗的体内过程呈线性药代动力学特征,而其他参数如t1/2则不随剂量变化而变化。考察进食对药物吸收的影响结果表明,进食与空腹给药后,药物的Cmax无显著性差异,AUC0-t有差异,进食对药物的吸收有轻度影响。二、川丁特罗对大鼠肝微粒体细胞色素P450酶的影响为了研究川丁特罗对主要代谢酶的影响,本文考察了健康Wistar大鼠连续7天灌胃给予川丁特罗(9.0μg/kg)后,大鼠肝微粒体的蛋白含量和CYP450酶总含量的变化以及主要亚型(CYP1A2、CYP2D6、CYP3A4、CYP2C9和CYP2C19)的活性变化。结果表明:Wistar大鼠给药后,肝微粒体中蛋白含量和CYP450总含量与空白对照组相比没有显著性差异,含量未见变化。几种主要的亚型的活性也未受影响。由于CYP1A2、CYP2D6、CYP3A4、CYP2C9和CYP2C19这5种酶的含量约占肝微粒体CYP450酶的90%,本试验结果可初步推断,川丁特罗不会抑制或诱导CYP450酶的产生和活力,即不会改变合并给药时其他药物的代谢速率,进而影响其药效的发挥。三、川丁特罗HepG2细胞细胞色素P450 mRNA表达的影响建立人肝癌(HepG2)细胞体外模型,首次考察了川丁特罗对人CYP450酶mRNA表达的影响,为临床合联合用药提供理论依据。人肝癌细胞(HepG2)中分别加入浓度为2.4、12、60、300、1200和4800 pg/mL的川丁特罗溶液,MTT法检测药物作用下的细胞增殖。采用RT-PCR法检测HepG2细胞中CYP1A1,CYP2E1和CYP3A5亚型的mRNA表达量。结果显示:在2.4~4800 pg/mL的范围内,川丁特罗未抑制HepG2细胞的增殖。与对照组相比,川丁特罗给药组CYP3A5和CYP2E1 mRNA表达无明显变化,而CYP1A1 mRNA表达水平明显降低(P<0.01)。表明川丁特罗能明显抑制HepG2细胞中CYP1A1 mRNA表达,而对CYP3A5和CYP2E1表达则无抑制和诱导作用。四、川丁特罗在MDCK-MDR1细胞模型中的转运研究建立MDCK-MDR1单层细胞体外药物转运模型,对模型进行评价。将MDCK和MDCK-MDR1细胞在Transwell多聚碳酸酯膜上培养5天后,考察了跨膜电阻、荧光黄的表观渗透率和Rho123在细胞上的转运。MDCK和MDCK-MDR1细胞的跨膜电阻分别为591.6±7.4 ?·cm2和140.4±6.6 ?·cm2,荧光黄的表观渗透率为(Papp)分别为(2.35±0.23)×10-6和(4.51±0.28)×10-6 cm/s。在Rho123的转运试验中,MDCK-MDR1的外排比率为5.16,明显高于MDCK细胞,表明MDCK细胞在稳定转染人mdr1基因后,人源性P-gp产生高表达,外排功能增加。研究表明,成功建立MDCK-MDR1细胞模型,各项考察指标符合规定。川丁特罗对P-gp介导的Rho123在模型中外排的影响,结果显示:10μmol/L和100μmol/L川丁特罗不同程度上均降低了Rho123的外排比率。Rho123的外排率从3.11降到了2.27和1.82。统计分析发现,加入川丁特罗后,Rho123在MDCK-MDR1细胞的Papp值与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。这表明川丁特罗抑制了P-gp介导的Rho123外排,可能为P-gp的抑制剂。在川丁特罗MDCK-MDR1细胞双向转运试验中,采用LC/MS/MS法测定川丁特罗的含量。结果显示:川丁特罗在MDCK-MDR1和MDCK细胞上外排率分别为1.2和1.05,净外排率为1.14,表明川丁特罗不是P-gp的底物。在川丁特罗对P-gp ATP酶的影响实验研究中发现,川丁特罗能够抑制ATP酶的活性,从而抑制P-gp的外排。五、川丁特罗在Caco-2细胞模型中的转运研究建立Caco-2单层细胞模型,观察Caco-2细胞间连接紧密,TEER>250 ?·cm2,荧光黄的Papp<0.5×10-6 cm/s。结果表明,本实验室所建立的Caco-2细胞模型指标符合要求。采用建立的Caco-2细胞模型考察川丁特罗的双向转运,将P-gp抑制剂维拉帕米作为对照组。结果显示,实验组川丁特罗的外排率为1.078;维拉帕米对照组的川丁特罗外排率为1.11。统计结果表明两者无显著性差异(P>0.05),P-gp的抑制不能显著改变川丁特罗的外排率,因此川丁特罗不是P-gp的底物。