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轮状病毒(Rotavirus,RV)是引起婴幼儿腹泻进而死亡的主要致病因素之一[1,2],每年因此死亡人数>100万[3,4]。目前全球致力于轮状病毒的消灭和提高婴幼儿的生存率,已开发出几种安全而有效的轮状病毒疫苗,如葛兰素史克公司生产的Rotarix(G1P[8]型),默克公司生产的Rotateq(G1-G4P[8]型),以及我国兰州生物制品研究所生产的罗特威(G10P[15]型)[5],但Rotarix和Rotateq在一些贫穷的发展中国家(如非洲、亚洲等)疫苗需求量大的地方免疫效果却不理想;另外,这两种轮状病毒疫苗(单价活疫苗(Rotarix[RV1])和五价人牛重组活疫苗(Rota Teq[RV5]))均为减毒活疫苗[6]。虽然,减毒活疫苗免疫原性更强,作用时间更长,但减毒活疫苗也存在一定的潜在危险,如肠套叠、毒株毒力返祖[7];而罗特威仅在我国上市,是羊轮状病毒减毒株,其G10及P[15]血清型并不是我国或者全球流行的G1,G4或者P[8]型[5]。所以研发出安全高效经济的新型RV疫苗很有必要。本研究将经前期筛选后的具有佐剂活性的LTB抗原表位PT8A整合到VP8*基因的C端和N端,构建含有分子内佐剂的RV亚单位疫苗,以获得更安全有效的候选VP8*亚单位疫苗。目的评价PT8A与VP8*融合表达后是否具有增强VP8*亚单位疫苗的分子内佐剂活性。方法1.PCR法扩增得到目的基因片段PT8A-VP8和VP8-PT8A;2.构建重组质粒p ET32a-PT8A-VP8和p ET32a-VP8-PT8A并测序;3.表达融合蛋白并纯化,去除内毒素;4.免疫Balb/c小鼠;5.收集小鼠血清及组织并保存;6.ELISA和免疫组化等检测相关细胞因子含量及其免疫效应。结果1.成功构建重组质粒p ET32a-PT8A-VP8和p ET32a-VP8-PT8A。2.融合蛋白以包涵体形式大量表达并纯化。3.ELISA检测特异性抗体,结果显示:VP8*+LTB组和VP8-PT8A组的抗体明显升高,与VP8*组的抗体滴度(OD值)有显著性差异(P<0.05),而PT8A-VP8组与VP8*组没有显著性差异(P>0.05)。4.VP8*+LTB组和VP8-PT8A组的抗体效价是VP8*组和PT8A-VP8组的4倍,是未免小鼠的256倍;5.s Ig A的检测量:VP8*+LTB组和VP8-PT8A组的抗体明显升高,与VP8*组的OD值有显著性差异(P<0.01),而PT8A-VP8组与VP8*组没有显著性差异(P>0.05)。6.(1)TLR2仅在脾组织中表达,其平均光密度值(Mean IOD)在VP8*+LTB组高于VP8*组,且有显著性差异(P<0.05),与PT8A-VP8组和VP8-PT8A组无显著性差异(P>0.05),说明,VP8-PT8A的佐剂活性与TLR2无关,而LTB在脾(即中枢免疫器官)中的佐剂活性与TLR2相关。在鼻黏膜和肠黏膜(即外周免疫器官)中,各组Mean IOD值差别不大,说明LTB在黏膜免疫组织中不经过TLR2发挥作用。(2)JNK1/2蛋白在脾中VP8-PT8A组明显高于其它三组,提示VP8-PT8A的佐剂活性可能与JNK1/2的活化相关。在鼻黏膜中,虽然VP8-PT8A组明显高于其它三组,有显著性差异(P<0.05)。但是,无佐剂活性的PT8A-VP8组也高于VP8*组,与LTB佐剂组相似,也有显著性差异(P<0.05),而且,VP8-PT8A组和PT8A-VP8组的Mean IOD相当,是LTB佐剂组的1.8倍和VP8*组的2倍,提示,在肠黏膜组织中,无论是LTB还是LTB-PT8A导致JNK1/2的活化,其佐剂活性均与JNK1/2的活化无直接的关系;(3)MAP2K3蛋白:在脾和鼻黏膜组织中VP8-PT8A组的Mean IOD均小于其它组,且有显著性差异(P<0.05),而VP8*与LTB+VP8*组相当;在肠黏膜组织中,VP8-PT8A组与VP8*组相当,且均大于PT8A-VP8组和LTB+VP8*组,并且有显著性差异(P<0.05),说明,MAP2K3与LTB的佐剂活性无关,PT8A(C端)的佐剂活性可能也与MAP2K3无关。但是,总体上,在脾、鼻腔和肠三种组织中,佐剂活性高的VP8-PT8A组和LTB+VP8*组的MAP2K3表达水平均低于或者略低于VP8*组,也有显著性差异(P<0.05),说明,MAP2K3的活化抑制了PT8A(C端)或者LTB发挥免疫佐剂活性。结论1.PT8A多肽融合在VP8*基因的C端后可显著增强重组轮状病毒VP8*亚单位疫苗的免疫效应即有佐剂活性,而融合在N端无佐剂活性。2.LTB的佐剂活性与TLR2通路相关,而PT8A(C端)与TLR2无关。3.PT8A(C端)可能含有与LTB佐剂完全不同的分子机制。4.LTB和PT8A(C端)的佐剂活性与MAP2K3信号转导途径呈负相关性。5.在脾中(中枢免疫器官),PT8A(C端)的佐剂活性与JNK1/2信号转导通路有可能相关。6.在黏膜免疫系统(外周免疫器官)中,无论是LTB还是PT8A(C端),其佐剂活性均可能与JNK1/2的活化无直接的关系。