第一部分:肥胖,代谢综合征对前列腺及下尿路症状的作用研究研究背景:从上世纪末至本世纪初,肥胖(obesity)已经成为了一种广泛存在社会现象。在世界范围内可预防的引发死亡和疾病的相关因素中,肥胖占领先地位,无论是儿童还是成年人,肥胖症的比率一直在上升。肥胖一般认为是由于脂类,尤其是甘油三酯在体内过多聚集所导致的一种病理状态,可分为单纯性肥胖和继发性肥胖两种类型,日常生活中所见到的肥胖一般为单纯性肥胖,所占的比例在所有肥胖症的95%以上,医学上认为单纯性肥胖为原发性肥胖,与个人遗传因素,饮食和运动习惯相关。目前,肥胖问题已不再局限于发达国家,对于经济快速发展的地区,在人们的饮食习惯改变及品种供应日益丰富和生活方式向静态变化的趋势下,肥胖问题也迅速发展。在我国,自20世纪90年代与80年代起,超重者的比例已增加了近1倍,达到20-30%,城市人口中达到35-40%;我国大多人依然认为肥胖是由于饮食过度及不注意个人饮食及运动习惯造成的,不将其视作一种疾病,从而使得肥胖症控制欠佳而更为普遍,进而引发糖尿病,心血管疾病,肿瘤及睡眠-呼吸紊乱等疾病,近来更多的研究认为肥胖更是引发代谢综合征的主要危险因素。代谢综合征(metabolic syndromes,Met S)是近10年来受到普遍重视的一类疾病综合征群,其主要表现为中心性肥胖,高血压,高血糖,糖耐量异常(胰岛素抵抗),高密度脂蛋白胆固醇血清水平降低,血脂代谢紊乱和微量蛋白异常等,其与糖尿病,代谢性疾病及心血管疾病的发病密切相关且发病率逐年攀升,在北美地区,Met S发病率已达34-39%,严重影响了人类的身心健康及生活质量,已成为了世界性的公共卫生问题。前列腺增生症(BPH),是以前列腺两侧叶和中叶增生为主所引起的老年男性常见疾病之一,往往伴有下尿路症状(LUTS);下尿路症状是一系列以排尿不适症状形成的综合征候群,已有大量证据表明肥胖,腰围,体质指数及体脂分布等与BPH和LUTS的发病相关。随着肥胖与代谢综合征研究的不断深入。近年来,Met S与BPH,LUTS,膀胱过度活动症(OAB)及勃起功能障碍(ED)等泌尿生殖系疾病的相关性研究成为了热点。虽然已经有部分临床研究报道表明了在人体Met S与BPH,LUTS具有相关性,但由于此类研究领域仍较新,研究时间有限,动物实验及分子机制依然不清,实验方法及相关结论也不完善,大量临床结论的基础研究证据依然空白,缺乏完善的动物实验来进行佐证,动物实验是进一步了解分子机制最有效的方式,建立合理有效的动物模型对深入了解疾病的发生发展有重要作用。因此,我们尝试使用肥胖动物模型来研究关于肥胖与代谢综合症在泌尿系并发症的影响,并对其代谢综合征诱导的下尿路症状下分子通路表达进行了初步研究。研究目的:1.以肥胖小鼠(B6.V-Lepob/J,obob mice)为研究对象,观察肥胖可能导致代谢综合征的特点,并行尿流动力学实验,了解肥胖,代谢综合征对尿控及排尿功能的改变情况;2.对两组小鼠存在明显差异的指标进行相关性及回归分析,了解造成排尿习惯改变的潜在危险因素并探讨相关分子机制,为临床实验及研究提供证据支持;研究方法:1.动物模型的建立:拟使用雄性瘦素(leptin)受体敲除小鼠(B6.V-Lepob/J小鼠)为实验组,正常C57BL/6N品系雄性小鼠为对照组(n=40)饲喂普通饲料28周,观察不同时间点小鼠体重(BW),身长(BL),腰围(WC),血糖水平(BG),空腹糖耐量(GTT),胰岛素水平(INS),总胆固醇含量(TCHO),游离脂肪酸水平(FFA)的变化情况;2.按照时间点分布,观察小鼠尿动力学情况,通过尿量频率实验和膀胱内压检查实验共同实现;3.通过影像学核磁共振检查,了解实验中期和末期肥胖对前列腺及体脂分布情况的影响;并就相对显著指标与排尿频率进行相关性分析;4.对28周后的小鼠组织行免疫组织化学染色和western blot(WB)检测相关蛋白表达情况;结果:1.Leptin缺陷B6.V-Lepob/J小鼠较正常C57BL/6N小鼠更易于表现出包括中心性肥胖,高血糖,高胰岛素血症,血清总胆固醇升高等Met S症状;2.Leptin缺陷B6.V-Lepob/J小鼠较正常C57BL/6N小鼠易于出现下尿路改变,表现为排尿次数增多,膀胱储尿容量改变,单次尿量减少,基础膀胱压及排尿压峰值增高及排尿间隔时间减少等表现;3.影像学核磁共振检测Leptin缺陷B6.V-Lepob/J小鼠较正常C57BL/6N小鼠具有更大的前列腺及内脏脂肪体积;4.对两组小鼠中具有统计学差异的数据行Person相关性分析后表明:体重指数(R=0.638),腹腔内脂肪含量(R=0.853),前列腺体积(R=0.706),空腹血糖水平(R=0.712),血清胰岛素水平(R=0.628)与血清胆固醇(R=0.729)含量与排尿频率强相关;年龄(R=0.437),体重(R=0.483),腰围(R=0.469),血清总胆固醇含量(R=0.467)与排尿频率弱相关;(p<0.05);5.免疫组织化学HE染色显示B6.V-Lepob/J小鼠较正常对照组小鼠的前列腺组织中腺体细胞大量增生,有少量炎性细胞浸润;WB结果显示B6.V-Lepob/J小鼠较正常对照组小鼠前列腺中的TGF-β表达增高;结论:1.Leptin缺陷B6.V-Lepob/J小鼠可以作为新型研究代谢综合征的动物模型,具有特征性,可重复性及相对稳定性;2.Leptin缺陷B6.V-Lepob/J小鼠可出现下尿路症状,主要以尿频症状为主,其与代谢综合征症状及腹腔脂肪分布具有正相关性;3.血糖水平,胰岛素水平,前列腺体积及腹部脂肪体积均是下尿路症状产生的危险因素,其中高血糖是下尿路症状的独立危险因素;第二部分:高脂饮食,氧化应激对小鼠压力性尿失禁作用的研究研究背景:尿失禁是一种以不自主尿液流出为主要症状的疾病,往往是由于膀胱括约肌功能下降或者是神经性功能损伤造成,虽然其发病对机体造成的损伤并不严重,但却会极大的降低患者的生活工作质量并影响其心理健康,且以女性多发,容易诱发患者出现自闭,抑郁及孤僻特点[1]。尿失禁在分类上有4种类型:压力性尿失禁最为常见,多由于膀胱盆腔组织松散所致;急迫性尿失禁常因膀胱过度活动症(overactive bladder,OAB)引发;混合型尿失禁则两者兼有,还有一类为功能性尿失禁,常由于药物及疾病等因素导致膀胱贮尿功能下降所致。目前全球统计的年轻女性尿失禁人群已占到20%-30%,30-40岁的中年女性发病率为30-40%及老年女性发病率增高达到30-50%;尿失禁的危险因素包括有年龄,种族与遗传因素,肥胖,分娩胎次等,其中尤以分娩对产道及盆底组织损伤最为常见,分娩产伤导致的盆底神经,肌肉的机械性损伤,同时可伴有缺血缺氧出现的局部组织氧化应激加重损伤,病患随着年龄增长,尿失禁的症状出现并有加重趋势。正常生理条件下,机体内存在多种氧自由基及抗氧化酶,平衡着机体的氧化及抗氧化平衡,在炎性浸润,蛋白酶分泌增加,可能会诱导产生大量氧化中间产物,这些中间产物会加重细胞和组织损伤,机体的抗氧化系统亦包括两种类型,一类以酶类抗氧化系统为主,包括有超氧化物歧化酶(SOD),过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)等;另一类则为非酶抗氧化系统,包括维生素C、维生素E、麦角硫因、谷胱甘肽等。在酶类抗氧化系统中,SOD作为最主要的抗氧化酶之一发挥着重要的作用,在分型上,SOD也可分为3类:SOD1,SOD2及SOD3,常在研究中用于机体的抗氧化应激能力的测评。长期的高热量,高脂肪饮食会诱发肥胖,高血糖症,胰岛素抵抗,高脂血症等一系列代谢综合征表现,在胰岛素抵抗情况下,生物机体抗感染及抗氧化应激能力也随之下降;压力性尿失禁与产伤相关已有大量证据报道,产伤过程中缺血缺氧情况下产生的氧化应激对机体的损伤及长期预后依然不清,有待更多合理的实验进一步研究探讨。研究目的:在上述背景基础上,我们设计了该课题实验,以Mn SOD平滑肌特异性敲除小鼠为研究对象,尝试发掘氧化应激,尤其是平滑肌中Mn SOD缺乏情况下小鼠尿失禁发生情况,更好的理解Mn SOD对于尿失禁的作用意义。研究方法:1.基因敲除动物:采用Cre-Lox P技术特异性敲除雌性小鼠(C57BL/6)平滑肌Mn SOD基因,然后运用聚合酶链反应(PCR)及免疫组化技术,对子代进行基因型鉴定,对符合条件保留的条件敲除小鼠纳入实验组(n=48),同时纳入相同数量的C57BL/6品系雌性小鼠为对照组(n=48);2.再将实验组小鼠与对照组小鼠与12周龄时进一步分亚组,分别使用高脂饲料(80%脂肪)及普通饲料饲喂12周,检测4组小鼠的在时间分布上的一般生长情况(体重,腰围,体重指数),血糖变化,排尿功能;3.24周后行阴道内球囊扩张模拟分娩产伤过程,测量术后4天,10天,20天的漏尿点(Leak point pressure,LPP)水平进而评估其尿失禁水平;4.实验结束取动物组织标本进行蛋白分析及形态学等体外实验;结果:1.基因型分析中PCR及4-羟基壬烯醛(HNE)免疫组化切片显示Mn SOD基因已基本敲除;2.饲喂高脂饮食的小鼠较普食小鼠体重明显增加,血糖增高,糖耐量异常,但组间无差异,饲喂普通饮食的小鼠无论基因敲除与否,体重未见明显改变,组间亦无统计学差异;3.饲喂高脂饮食合并基因敲除的小鼠在阴道扩张术后4天,10天时LPP水平明显低于其余组,普通饲料喂食的对照组小鼠LPP水平最高,10天后基本达正常水平,各组中大多数小鼠在术后20天LPP水平基本恢复到正常水平;4.饲喂高脂饮食小鼠尿道在术后4天抗氧化蛋白SOD表达水平低于正常小鼠;以Mn SOD敲除组为著,术后20天后,各组SOD表达水平基本恢复正常;结论:1.Cre-Lox P技术可用于Mn SOD特异性平滑肌敲除小鼠的制备;2.高脂饮食可诱导肥胖,高血糖,糖耐量异常等代谢综合症的出现;3.Mn SOD敲除后小鼠的漏点压水平降低,但这种水平降低可以被长期饲喂高脂饮食加重,也可以随时间恢复;4.抗氧化蛋白,尤其是Mn SOD对尿失禁的恢复可能具有一定意义。